基因测序让“孤儿病”不再孤独无依
罕见病又称“孤儿病”，由于单病种人群发病率低、病例分散等特点，长久以来罕见病研究处于医学研究的荒漠地带，未能引起临床医生的足够重视，导致许多罕见病患者不得不面临无法获得明确、及时的诊断亦或即使诊断明确却无药可医的两难境地。解决罕见病患者诊断难、治疗难的问题不仅是现代医学面临的重大挑战，也是社会发展提出的迫切需求。随着医学研究的进步和社会经济的发展，罕见病作为一组特殊疾病引起了研究者和临床工作者的广泛关注。目前，已知的罕见病已超过7000种，其中大部分罕见病与遗传相关，其中约80%是由先天性遗传缺陷引起的，且几乎所有的单基因遗传病均属罕见病。
图片来源于网络
多数罕见病存在异质性，包括遗传异质性和临床异质性，其中遗传异质性又包含座位异质性和等位基因异质性。基因座位上通常含有1个以上的突变等位基因，由这多个不同等位基因引起的表型差异为等位基因异质性。这样的表型差异可以是临床上截然不同的两种病，也可以是表型难以区分的两种疾病。传统的罕见病致病基因研究主要采用连锁分析、定位克隆以及候选基因测序等方法，十分耗时耗力。近年来基因测序技术的不断成熟以及使用成本的降低，使其在大规模人群中的运用逐渐成为现实。目前基因测序技术越来越多被应用于科学研究和临床诊断中。在人们所发布的四代技术中，NGS更为广泛的运用在罕见病诊断中，因此本文着重介绍NGS平台在罕见病诊断中发挥的作用。
NGS技术发现罕见病新致病基因
遗传性突变引起的罕见病
2009年9月Ng等在Nature杂志上发表了第一篇利用全外显子组测序研究遗传性疾病的方法学文章，利用安捷伦定制芯片捕获外显子和Illumina GAIIx平台对4名无亲缘关系的Freeman -Sheldon综合征患者进行外显子组高通量测序，准确的找出了位于MYH13基因中的突变，证实了FSS是一种由MYH3基因突变引起的常染色体显性遗传病证，首次证明了NGS方法在鉴定罕见病致病突变基因的准确性和可行性。随后，该团队又首次成功地从4例散发和家系（其中有1对同胞）未知病因的Miller综合征鉴定出单个候选突变基因 DHODH，并证实此基因编码嘧啶合成中一个关键的酶。
Kufs病（Kufs disease， KD）是一种罕见的成人型神经元蜡样脂褐质沉积症（neuronal ceroid lipofuscinosis， NCL）。根据受累个体的临床症状分为2类 ：A型表现为进展性肌阵挛癫痫和认知功能减退，B型表现为运动、行为学功能异常和痴呆。诊断Kufs病具有一定的挑战性，其症状表现与多种疾病相似，病理诊断可能需要脑组织活检。2011年，Nosková等在家系连锁分析、拷贝数变异和基因表达谱芯片分析基础上，使用外显子组测序和候选基因PCR扩增Sanger测序分析，在20个常染色体显性遗传KD受累家庭中，发现了位于DNAJC5基因上的c.346_348delCTC密码子缺失和c.344T>G 杂合子突变，该突变导致p.Leu116del缺失和p.Leu115Arg氨基酸改变。美国华盛顿大学医学院和美国纽约州国立发育障碍基础研究所研究人员也分别通过家系分析，利用安捷伦SureSelect 人50 Mb外显子组试剂盒、Illumina HiSeq 2000平台和候选基因Sanger测序分析发现了上述突变。目前确认CLN6基因突变可导致常染色体隐性遗传A型KD，DNAJC5基因突变可导致常染色体显性遗传A型KD，CTSF基因突变可导致常染色体隐性遗传B型KD。
非遗传性突变引起的罕见病
2010 年，Hoischen等首次证明利用外显子组测序可有效发现罕见病Denovo突变。他们利用安捷伦SureSelect外显子捕获试剂盒和Life Technologies SOLiD平台对4例Schinzel-Giedion综合征散发婴儿进行外显子测序分析，发现所有4个病例都存在SETBP1 基因杂合突变。他们又利用Sanger测序对婴儿父母的SETBP1基因进行验证，发现并无突变存在，暗示Schinzel-Giedion是一种由Denovo突变引起的显性罕见病。同样，对9例临床诊断为Schinzel-Giedion综合征患者Sanger测序，8例具有SETBP1基因的突变并且所有突变都发生在11 bp内，暗示该突变有着显负性作用或功能获得的作用。
2013 年，Shirley等在NEJM杂志上发表了一篇关于斯特奇-韦伯综合征（Sturge-Webersyndrome）的文章，证实GNAQ基因上的体细胞嵌合突变导致了斯特奇-韦伯综合征和葡萄酒色素痣（port-wine stains） 的发病。该团队首先利用Illumina Hiseq 2000平台对3名脑面血管瘤病患者的受累组织和正常组织进行了全基因组测序分析，找到1294个体细胞突变，通过与正常组织比对及VASST分析，最终确定患者染色体9q21的GNAQ基因发生了错义突变。
近几年，通过新一代测序技术发现的罕见病基因种类和数目呈快速上升趋势，包括了线粒体疾病、神经系统疾病、代谢疾病、血液疾病、心血管疾病、皮肤疾病、耳鼻喉科疾病、眼科疾病和胃肠道疾病等类别，涉及60多种罕见病。
NGS技术在国内应用进展
在中国，基因测序技术在罕见病诊断中逐渐发挥重要作用。华大基因作为国内最早一批开始运用基因测序技术的机构，其在临床诊断中的实力不可忽视。下面小编将介绍华大集团利用基因测序仪在临床诊断罕见病的若干实例。
辅助临床诊断
随着高通量测序技术的不断完善和生物信息学技术的高速发展，临床表型辅以分子诊断结果，可对遗传性疾病做出更为准确的诊断，尤其是对于那些临床诊断困准的罕见病具有重要意义，可大大缩减罕见病确诊的周期。例如，2014年9月，13个月龄女婴，足月顺产，出生时体质量2.85 kg，身高50 cm，而现体质量约2.9 kg，身高60 cm，临床表现为:喂养困难，牙齿缺失，全身脂肪含量极低，双手蜷缩，骨骼疑似变形，运动发育迟媛，坐立、翻身、行走均不能。其母否认妊娠期有任何异常，否认有任何家族病史，并称女婴曾就诊于北京、广州、湖南、深圳等多家医院，病因不明。华大基因对此女婴（Ⅱ-2）进行了全外显子测序，通过基因组数据深入地分析与查找，结果，在与 Costello综合征（OMIM#:218040）相关的HRAS基因上检出一个杂合的已知致病突变:c.34G>T（pGly12Cys）；经过家系验证，女婴父母（I-1、I-2）及哥哥（Ⅱ-1）均未携帯此突变，临床表型均正常，即为新发突变，提示该家系2代中有1例患者一一女婴因新发突变致病。Costello综合征为显性遗传病，杂合的有害突变即满足遗传模式，因此HRAS基因的杂合突变c.34G>T（p.Gly12Cys）应为女婴的致病原因。
表型重叠疾病准确分型
许多遗传病具有临床异质性，且部分疾病临床表型相互重叠或表型不典型，使得临床医生在进行鉴别诊断时困准重重。基因检测能够从分子层面找到致病源头，辅助临床医生鉴别诊断甚至纠正临床上的“错误诊断”。例如，2014年2月，孙先生，40岁，因近两年双下肢肌肉渐进性无力及萎缩而就诊。给孙先生进行的辅助检查提示肌酸激酶（creatine kinase， CK）值为4212.3U•L，肌电图检查结果显示为肌源性损害，医生诊断孙先生为疑似贝氏进行性肌营养不良（BMD）。基于临床诊断，孙先生在华大基因做了贝氏进行性肌营养不良相关的杜氏进行性肌营养不良（DMD）基因检测，但检测结果为阴性。
华大基因遗传专家重新对孙先生的临床表型进行了评估，明确其为进行性肌营养不良患者。通过对孙先生做了进行性肌营养不良相关31个基因的检测，结果显示，在导致肢带型肌营养不良2B型的DYSF基因上检出2个剪切突变c.144+1G>A和c342+1G>T，疑为致病突变。依据此基因检測结果，医生重新修正了之前的临床诊断，也为孙先生找到了致病原因。
个体化诊疗指导
个体化诊疗主要是指利用个体基因型或基因表达谱信息在分子水平上辅助临床做出诊断，从而增加诊断的准确性，井根据患者的遗传特征选择合适的治疗方案。针对由不同的基因突变引起的同一种疾病或同一类表型，其相应的治疗方案可能相差甚远。
例如，2014年8月，某儿童医院，女婴，刚满月因体检发现血糖高达27.3 mmol/ L而就诊。医生怀疑其可能患有罕见的新生儿糖尿病，但临床无法确诊。华大基因为女婴进行了单基因糖尿病相关基因集检测并进行分型，结果显示在KCNJ11基因上检出一个已知致病的突变c.341G>A。该基因突变可导致β细胞ATP敏感性钾通道关闭异常，进而使胰岛素分泌不足，导致糖尿病的发生。有研究表明，因磺胺类药物可以通过独立的途径来关闭ATP敏感性钾通道，促进胰岛素分泌，所以，KCNJ11基因突变所致PNDM长期治疗时，尝试用磺胺类药物替代胰岛素治疗，能获得更好的疗效和生活质量。因此，基因检测找到了受检者的病因，验证了医生的疑似诊断，同时也为医生给受检者进行个体化治疗，提供了分子遗传学参考依据。
展望
综上所述，NGS技术正逐步广泛应用于军见病的临床分子诊疗，并发挥了极大的技术优势，逐步获得医学界的广泛认可，但仍然存在许多诸如法律法规、伦理、质量控制等方面的问题亟需探讨解决，这其中最棘手的问题主要在于变异位点的解析。高通量测序结果会产生庞大的数据量，但相较而言，目前人类基因组变异与临床表型间对应关系的研究仍存在很大的局限性，如何从海量的数据中准确找到有意义的位点，使之能有效的应用于临床诊疗，这对科研人员是一个巨大的挑战。
尽管存在挑战，高通量測序为罕见病的临床诊断和个性化治疗带来了前所未有的机遇。相信随着对罕见病研究的不断深入、高通量测序技术的不断发展、变异数据库的建立以及相关法律法规的完善，高通量测序技术在罕见病临床分子诊疗领域的应用将逐步普及。
后记
经过数周的资料查找，小编了解了精准医疗所含内容包罗万象，举一千从，不仅仅是前文提到的质谱和基因测序，波谱（MRI等）、光谱（激光共聚焦等）等技术都为精准医疗的发展做出了重大贡献。鉴于小编能力有限，无法为众网友提供全面、有深度的内容。在这里，小编想说，朝闻道，遨游四海，寻有识之士，希望您为我们提供更全面、更有深度的内容，让我们共同推进实现你我的健康中国梦而努力。
