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利用QTRAP研究分析细胞色素P450（CYP）反应表型

2020.3.08

图1. 从CYP 2B6（M3）作用得到安非他酮主要代谢产物的结构信息和碎片裂解方式。

本文研究鉴定了各种浓度下的酶代谢的安非他酮的代谢物，实验结果证明QTRAP质谱十分适合作各类浓度的表型分析。

在评价药物相互作用和PK值的变化时，确定生物酶对药物的代谢作用至关重要。理想的条件下，应当知道代谢物及其相关的代谢途径，并用来作为不同临床相关浓度的酶动力学的定量研究。然而，在早期药物发现过程中，因为传统的代谢物鉴定和合成耗时又耗力，因而底物损耗被常常用作这些研究。由于灵敏度的限制，一般会在高底物浓度条件下，分离这些培养的代谢物。从如此高浓度的体外代谢研究结果看，似乎不会直接转移到体内的情形，基于这些原因，在早期的药物研究中限制了使用反应表型。

QTRAP是一类组合质谱技术的新机型，具备完整的三重四极杆MS/MS的质谱特点，也具备线性离子阱的功能，同时还将两者的功能巧妙地结合起来，创造出很多特有的“串联四极杆-线性离子阱”（以下称“杆-阱”）的新串联方式，在药代分析过程中，一次进样即可高效获得“全部有效信息”，经常被用作底物浓度低的动力学研究，包括表型分析。

图2. 从CYP 2C19（M5）作用得到安非他酮主要氧化代谢物的碎片信息。

安非他酮在人体内被代谢为3种主要的代谢产物，是高浓度2B6底物的1，2，3代谢物。以前的体外代谢鉴定工作是由传统的离子阱质谱在浓度高达1mM底物的条件下完成的，这样就人为的造成了体外数据和临床数据的分割，因为临床有效浓度一般在0.5~1μM。本文研究鉴定了各种浓度下的酶代谢的安非他酮的代谢物，实验结果证明QTRAP质谱十分适合作各类浓度的表型分析。

药品和方法

传统方法是通过选择抗体或化学抑制剂，通过不同浓度的安非他酮结合人体细胞色素P450（rhCYPs）和人体肝脏线粒体（HLM）作表型分析。培养液中有磷酸钾（50mM，pH 7.4），氯化镁（5mM），rhCYP（pmole/ml，随不同CYP而改变），或者人体肝脏线粒体（HLM，0.5mg/ml），和不同浓度的安非他酮。加入原型辅酶Ⅱ（NADPH，学名烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）启动反应，加入含内标的乙腈可中止反应。按时间0，5，10，20min收集样品。实验在AB 4000 QTRAP LC/MS/MS完成，液相色谱为岛津公司LC-20A和自动进样器，色谱柱2X100 Luna 3μM C18，定量实验和代谢物鉴定实验一次完成。

图3. 仅从HLM（人体肝脏线粒体）得到安非他酮主要代谢物的结构信息和碎裂机理。

Qtrap实验方法

1．pMRM-EPI 实验方法（pMRM切换至增强子离子扫描）：通过LightSight软件自动设定和预计建立pMRM的母子离子对，这些MRM包含了所有可能产生的代谢物的母子离子，每对离子的驻留时间均为5ms，如果发现预计代谢物，仪器就自动切换到增强子离子扫描，即线性离子阱的高灵敏度子离子扫描，快速得到高质量的MS/MS谱图。由于此实验关注代谢物鉴定，所以各种浓度的样品均用一种方法来分析。

2．EMS-EPI实验方法（增强全扫描切换至增强子离子扫描）：同样原理，在高浓度样品条件下，可以使用LightSight软件计算出可能代谢物，完成EMS IDA ，即高灵敏度的全扫描引导的数据相关的子离子扫描扫描。

图4. 主要安非他酮代谢物和几种同功酶、HLM的形成途径。

3．MRM-EPI实验：从pMRM-EPI实验方法修正得MRM-EPI方法，它包括母药及所有鉴定出的代谢物的母子离子对表，并采用较长的驻留时间，每个EPI 的驻留时间为15ms，得到最佳的谱图。该实验侧重定量分析，但同时可以得到高质量的MS/MS谱图。

结果和讨论

QTRAP系统的分析策略

QTRAP MS具有三种独特的“杆-阱”采集数据模式，特别适合早期药物开发阶段研究新化学实体的表型反应。

1．pMRM-EPI 方法用来鉴定可能的代谢物和作半定量分析代谢物形成过程，新的pMRM 算法可以覆盖所有可能产生的代谢物及其碎片等信息，从而完成MRM扫描。这种采集方式的灵敏度很高，即使在底物浓度很低的情况下（0.1~1μM），也可以很好的检测和鉴定代谢物。增强子离子扫描EPI可以提供高灵敏度的MS/MS谱图，即使没有合成出标准品，也可以建立相应的离子对。与此同时，pMRM半定量结果，还可以帮助确定每一个CYP的主要代谢途径，这个也十分重要。

图5. M3（256/238/167在存在和不存在抗体或化学抑制剂的产生过程（1μM安非他酮）。

2．EMS-EPI实验可用于鉴定在整个样品反应面板上rhCYP培养的高浓度的主要代谢物，选择高浓度底物实验的好处是避免丢失pMRM 遗漏一些代谢物。

最终的定量结果可以通过串联四极杆MRM方法或MRM-EPI完成。用MRM-EPI的最大好处就是它不仅可以提供定量结果，而且同时还可以获得可信的MS/MS谱图，这在研究很多种代谢物的时候非常重要，可以有效地避免相似代谢物或底物带来的“假阳性”结果，还不需要用标准品来“甄别”这样的假阳性。基于同时得到底物耗损和代谢物产生的数据，就可以确定每一种CYP的底物代谢机理在HLM中的分布，还计算出酶动力学参数。

安非他酮表型结果

使用Qtrap（QqQ/LIT）新技术，共确定出８个主要的一相代谢物（M1-M8）及其相对于CYP2B6、2C19、3A4、1A2、2E1的代谢途径，并且通过pMRM-EPI测试不同浓度下的底物浓度还鉴定了一个非-CYP 酶途径（表1）。还有另一个代谢物M9也通过EMS-EPI分析100μM CYP3A4途径时被鉴定，而pMRM-EPI在分析1μM 底物时也将其鉴定出来（表1）。