透析制备中性胶原蛋白凝胶
简介
在体内，细胞存在于富含I型胶原蛋白的三维细胞外基质环境内，所以三维基质是天然的组织工程学支架。水凝胶因具有与多数组织天然细胞外基质相似的结构和良好的生物相容性，故而被作为工程组织支架的首选。
I型胶原蛋白广泛存在于自然界，在大部分的结缔组织中，是主要的细胞外基质成分，其具有典型的层级结构。多肽链的一级结构由重复的（Gly-X-Y）n组成，每三位由甘氨酸占据，X通常为脯氨酸，Y为羟基脯氨酸。3个α链交织形成3螺旋，进一步形成纤维丝和纤维。整个结构由分子间的氢键和共价键以及侧链氨基酸残基间的离子、疏水及静电作用力稳定。
基于胶原蛋白的材料已在医学领域应用多年，其优势包括良好的生物相容性、无毒性、无抗原性和可生物降解等。胶原蛋白支架可用作细胞粘附、增殖和分化的底物，也可通过体外重建形成微纤维结构，模拟天然细胞外基质，所以其被认为是理想的组织工程学材料。
胶原蛋白生物材料通常需要一定程度的交联，以稳定结构。化学交联可将多肽链交联形成网状，常用的交联剂包括戊二醛、EDC、N-羟基琥珀酰亚胺、异氰酸酯、单宁酸等。此外，光化学交联也是常用的方法。酶也可用于交联，如转谷氨酰胺酶可选择性介导相邻蛋白纤维上谷氨酸盐和赖氨酸的化学反应，形成共价酰胺结合，增强3D基质。生物聚合物也可通过非共价交联键稳定，如壳聚糖氨基基团和胶原蛋白羧基基团间形成的离子键。
胶原蛋白溶液合适的pH可促进蛋白链之间离子反应的发生，胶原蛋白在酸性pH条件下可溶，所以，在此条件下，胶原蛋白不能形成有序的层级结构。所以对胶原蛋白进行中和是制备凝胶的一种方法。在合适的条件下，中和过程伴随着胶原蛋白分子聚集并排列形成细纤维。在此过程中，添加化学试剂可优化最终材料的物理、化学和机械特性，但也可能影响其生物学特性和细胞粘附能力。本实验使用透析法作为中和胶原蛋白溶液的方法，以减少制备过程中化学试剂的使用数量。
实验
胶原蛋白从年轻白鼠尾部肌腱中分离。肌腱从粘附组织上刮离，用去离子水漂洗，置于8℃ 0.1M 醋酸中72h。离心去除杂质和不溶性成分。然后将胶原蛋白溶液冻干。
制备1%胶原蛋白-醋酸溶液（起始pH=2.9），置于12-14kD Spectra/Por 再生纤维素透析袋内。为确定最佳处理条件，分别使用3种透析液：水（pH=7）、0.1M NaOH （pH=13）以及10% NaCl（pH=7），体积为透析样品12倍。透析于6℃进行，连续搅拌，每12h更换透析液，以控制pH值。透析进行7天后结束，此时透析液的pH值不再发生变化，说明胶原蛋白溶液的pH已与周围透析液一致。
由于某些分析技术要求在无水条件下进行，所以制备的材料采用空气干燥或冻干。透析制备的胶原蛋白凝胶置于聚乙烯薄片上空气干燥3天（干燥胶原蛋白），以进行FTIR-ATR、热分析和接触角检测。三类样品冻干后（冻干胶原蛋白）检测：直径16mm/长10mm的胶原蛋白用于SEM成像检测、直径16mm/1mm厚的胶原蛋白用于体外测试、40mm长/2mm厚/5mm宽的胶原蛋白用于机械分析。
此外，为比较中性胶原蛋白和酸性胶原蛋白，制备了酸性胶原蛋白薄膜，即将1%胶原蛋白-醋酸溶液倒于聚乙烯薄片上，空气干燥。
结果和讨论
以不同溶液透析获得的材料存在显著差异：0.1M NaOH透析获得的材料透明，但为半流体，不能维持其性状；10% NaCl透析获得的材料为白色、相对柔软的凝胶；而以纯水透析获得的材料透明、性状保持良好、耐受一定的压力、具有弹性，且在37℃孵育24后，仍可保持稳定结构。干燥后的中性胶原蛋白凝胶形成相对坚硬、多孔的海绵结构。SEM成像分析可观察到材料内部孔壁表面的纤维样突出，说明胶原蛋白链在透析过程中具有自组织能力，且红外光谱分析也证实中性胶原蛋白结构更有序，且含有大量的三螺旋结构。对中性胶原蛋白的热降解分析显示，其具有较高的降解温度，说明其更稳定。对中性胶原蛋白的抗张强度测试也表明，其内部胶原蛋白链存在多种交互，稳定了蛋白组织结构。冻干/干燥中性胶原蛋白具有较强的膨胀系数。此外，对胶原蛋白材料的体外生物学测试显示，细胞可耐受中性胶原蛋白。
实验结果证明，通过透析工艺，可制备稳定、透明的胶原蛋白水凝胶，不溶于水和PBS缓冲液，且可显著膨胀。改变胶原蛋白溶液的pH值，可获得更有序的结构，与天然胶原蛋白的三螺旋相近，且相比酸性胶原蛋白薄膜，材料的热稳定性更出色。凝胶冻干后，可获得多孔、立体、形状稳定的材料，材料适于细胞生长，但由于材料表面无孔，细胞不会迁移进入支架内部结构。
透析中和法还可用于制备胶原蛋白和其它蛋白混合的水凝胶，如弹性蛋白以及糖胺聚糖。这些混合物为聚合电解质，所以离子及静电反应可在分子间发生，从而改变胶原蛋白的结构。不同大分子的添加可对水凝胶形成正面或负面的影响，但添加量不应过多，以避免改变水凝胶的稳定性，而且分子量应足够大，以防止在透析过程中通过膜孔而损失。
编者出于交流目的编译、介绍此文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：Skopinska-Wisniewska J., Olszewski K., Bajek A., et al., Dialysis as a method of obtaining neutral collagen gels. Material Science and Engineering C, 2014, 40: 65-70.
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