FDA关于粗品肝素钠来源检测的方法（三）

3. 实时荧光定量PCR扩增
设计该操作流程/步骤是为使用Cepheid的SmartCycler分析猪源肝素样品中反刍动物DNA的存在。在其他操作平台上使用该步骤需要适当的加以调整以验证这部分是否符合（相对应平台的）标准程序。
 
3.1. 准备实时检测
a. 从冰箱中取出装有样品制备珠管的可重复用密封袋。从密封区域顶部的缺口
撕开袋子。
b. 从袋中取出所需数量的管子，并轻轻打开每一根管子。
c. 向每管中加入25 µL无核酸水（无核酸污染的水），用枪头混合后盖上管盖。
d. 使用微量离心机将所有管子快速离心5s。
e. 珠子空白对照（珠子+无DNA的水）必须与每一批待测样品同时检测。
 
3.2. 步骤
a. 分装25 µL先前准备好的预混液（珠子和水）至SmartCycler PCR反应管。
b. 向每一根对应的PCR反应管中加入1 µL样品。
c. 盖上管盖，在SmartCycler离心机中离心5s。
d. 将PCR反应管放入SmartCycler区块的每一孔中并盖上各个盖子。
e. 准备运行程序：
f. 点击"Create Run"图标。染料设置选择FCTC。
g. 选择操作规程（见3.3部分）。
h. 选择适当数量的位点（即在运行的PCR管的数量）
i. 给每一个位点标注一个与每管组分相对应的样品ID。
j. 点击"Start Run"。
注：阳性结果需要有一个循环阈值（Ct值）。
 
3.3 PCR反应条件
这一操作规程必须在PCR运行开始前加以设定。使用唯一的名称保存参数。
 
PCR程序：
第一阶段：95.0°C 120s（光学元件关闭）
第二阶段：45个循环
95.0°C 10s（光学元件关闭）
56.0°C 60s（光学元件开启）
注：分析时，Ct值应设定成缺省值30
 
4. 结果分析
染料设定为FCTC，用于荧光检测。反刍动物DNA的阳性结果的判定是一个样品在FAM通道45个反应循环之前出现Ct值。猪的材料的阳性结果是在TxR通道出现阳性的Ct值。内部扩增控制（IAC）在Cy5通道中报告，有助于降低假阴性报告。许多不同类型肝素样品含有抑制剂。本试验包括一个IAC，以确保PCR的条件是合适的，这样，最大限度地减少由热启动酶的抑制造成的假阴性结果报告。具体地讲，IAC可以反映样品中存在PCR抑制因子时报道的阴性结果。引物与探针能结合反应混合物中合成的序列。
当样品中没有PCR抑制因子，而靶目标没有扩增时，IAC应当产生Ct值为32-37之间的信号。如果目标样品是高浓度，IAC可能会也可能不会报告由于竞争而出现的扩增。这是正常的。
如果IAC在Ct值37处仍未出现，或者在目的扩增中没有报告（其Ct值），样品可能含有阻止目的检测的PCR抑制剂。如果观察到这一结果，建议将分装的新的肝素粗品重提并额外纯化后使用。
对于反刍动物样品的阳性结果，应当用PCR对同一DNA样品额外检测两次，即全部三次检测结果均为阳性的，则确认该样品为阳性。