一、实验讨论
我们采用两次酶消化、梯度离心分离得到脑微血管段，探索各种不同的培养条件，成功地进行了较纯的大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养，内皮细胞纯度可达90%以上，而且细胞得率较高，10只动物可培养8~10个35 mm一次性塑料培养皿，培养面积大约80~100 cm2，与国内的一些方法[3~5]相比，细胞得率有明显的提高。
由于新生鼠易于混有较多的杂细胞且大脑较小以及哺乳期大鼠优于超过1月龄的大鼠[9]，我们采用2~3-
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大鼠脑微血管内皮细胞培养周龄哺乳期的SD大鼠作为培养材料。脑微血管内皮细胞原代培养的关键是首先分离获得纯度较高且活力好的脑微血管段。在解剖过程中仔细去除软脑膜、大血管及大脑白质收集大脑皮质，可减少成纤维细胞和平滑肌细胞的生长，对于提高内皮细胞的纯度具有重要意义。由于胶原酶对内皮细胞的损伤较小，我们采用0.1%Ⅱ型胶原酶消化剪碎后的大脑皮质分散组织，同组织匀浆法[3,10]相比，酶消化法可避免组织匀浆对内皮细胞的损伤，从而有利于提高细胞的活力。经胶原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖离心可分离脑微血管段与神经组织及大血管，得到底层的脑微血管段，这种方法被广泛应用于脑微血管段的分离[5~9,11,12]，我们发现20% BSA较15%葡聚糖而言，其分离获得的脑微血管段数量更多，而且脑微血管段状态更好更易贴壁生长。由于周细胞是脑微血管内皮细胞原代培养中最常见的杂细胞，它会明显抑制内皮细胞的生长[7]，因此原代培养中应尽量减少周细胞的数量，我们采用两次酶消化方法[7]，控制两次酶消化的时间，用0.1%胶原酶/消化酶分散出内皮细胞外围的周细胞，最后采用一定浓度的连续梯度的Percoll分离以去除周细胞和红细胞得到较纯的脑微血管段。在酶消化过程中加入适量的DNA酶可分散消化过程中释放的DNA所引起的微血管段凝结块，有利于增加微血管段的得率。对于Percoll离心，我们尝试了3个浓度(33%、45%及50%)后发现，浓度越大，脑微血管段离靠近离心管底的红细胞及周细胞越远，分离效果也越好，因此采用50%
Percoll效果最好，并且最好采用水平转头的低温离心机以提高离心效果。内皮细胞纯化的其他方法有机械刮除法、克隆培养法、FACS分类法[13]、Thy1.1免疫反应杀伤法[7,14]、采用血浆来源的胎牛血清[8]、磁珠结合法[10]等，但是我们发现机械刮除法和克隆培养法并不适合大鼠脑微血管内皮细胞的纯化，因为原代内皮细胞传代后状态不佳且易被杂细胞所抑制[7]，而后面几种方法比较昂贵不予推荐；血浆来源的胎牛血清不含PDGF，不促进杂细胞的生长，但是其较昂贵，可选择胎牛血清用于原代培养。 脑微血管内皮细胞的原代培养需要涂布明胶、鼠尾胶、纤连蛋白等基质以利于脑微血管段贴壁和内皮细胞的生长。我们尝试不同基质后发现其对脑微血管段的贴壁和内皮细胞的生长作用不同，纤连蛋白/IV型胶原优于鼠尾胶，而鼠尾胶比明胶好，而且接种密度的要求前者比后两者要低，后两者需要达到一定密度才有利于脑微血管段贴壁。另外我们发现内皮细胞不易生长于玻片上，而较易生长于塑料培养皿上，这与文献报道基本相符[8,14]。内皮细胞生长需要添加内皮细胞生长因子以促进内皮细胞的增殖抑制杂细胞的生长，我们采用bFGF可有效促进内皮细胞的生长，同时添加100 μg/ml肝素协同bFGF的作用并可抑制平滑肌细胞的生长[9]。同时为了保证内皮细胞的营养，并去除脑微血管段的残余碎片，我们采用20% FBS的血清浓度并隔天换液。
我们培养的脑微血管内皮细胞呈短梭形，区域性单层生长，随着培养时间的延长及内皮细胞的增殖，可见"漩涡状"分布，约5~7天后，各区域之间可逐渐融合，其形态和生长特点与大多数文献报道相似[6~9,11,12]。根据内皮细胞的短梭形的形态特点、Ⅷ因子相关抗原表达阳性可鉴定我们所培养的细胞确为脑微血管内皮细胞[3,5,8]。
我们的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养模型的建立，对于研究脑内皮的生理、生化及药理研究是一个较好的工具，同时可与星型胶质细胞共培养用于构建血脑屏障模型[1]。相信随着技术方法的不断改进，脑微血管内皮细胞体外培养的模型将逐渐接近于其在体特征，并被广泛应用于相关研究[1]。 参考文献 [1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287 [2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95 [3] 王建民等。解剖学杂志，1998，21：495 [4] 许彦钢等。微循环技术杂志，1997，2：63 [5] 钱志远等。细胞生物学杂志，1999，21：42 [6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139 [7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1 [8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23 [9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312 [10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554 [11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435 [12] Ichikawa N et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 1996, 36：45 [13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269 [14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473 | 
