RNA抽提和标记实验
实验方法原理
实验材料 从组织培养收获的细胞在组织培养中的细胞冻存的整个组织
试剂、试剂盒 磷酸盐缓冲液（PBS）TRIzol 试剂乙醇乙酸钠EDTA NaOHTris-ClTE 缓冲液固定化的 oligo-dT 引物
仪器、耗材 组织匀浆器热循环仪荧光扫描仪
实验步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1a. 若从收获的组织培养细胞开始：用 PBS 将细胞沉淀洗涤两次。
1b. 若从组织培养的细胞开始：每 2×107 细胞加入 1 ml TRIzol 再晃动混匀。
1c. 若从组织开始：每 100 mg 冰冻组织直接加入 4 ml TRIzol，用旋转刀片式组织匀浆器匀浆。
2. 加入 1/5 体积氯仿，摇振 15 s，静置 3 min。4℃ 12 000 g 离心 15 min。
3. 将上清轻轻转移到一个 15 ml 聚丙烯管内，记下体积。
4. 边混匀边逐滴加入等体积的 70％ 乙醇（终浓度 35％）。
5. 把从 2×107～1×108 细胞提取的上清加入一个放在 50 ml 离心管中的 RNeasy Maxi 柱内。
6. 在临床离心机的水平转头上室温，以 2880 g 离心 5 min。
7. 收集流出液，把它再倒回柱子上部，重复步骤 6 操作一次。
8. 弃去流出液，往柱子里加 15 ml RWl。20～25℃， 2880 g 离心 5 min。
9. 弃去流出液，往柱子里加 10 ml RPE。20～25℃， 2880 g 离心 5 min。
10. 弃去流出液，再次往柱子里加 10 ml RPE。20～25℃，2880 g 离心 10 min。弃去流出液。
11. 将柱子放入一个新的 50 ml 锥形聚丙烯离心管，加入 1 ml DEPC 处理过的水（试剂盒附带）。静置 1 min。20～25℃，2880 g 离心 5 min，不要弃去流出液。
12. 再往柱子里加入 1 ml DEPC 处理过的水。放入上面的离心管静置 1 min。20～25℃，2880 g 离心 10 min。
13. 按 400 ul 每管将洗脱液分装到 1.5 ml 微量离心管里。
14. 每管加入 1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2.）然后加入 1 ml 100％ 乙醇，振荡混合，室温静置 15 min。
15. 4℃，12 000 g 离心15 min。用 75％ 乙醇洗涤沉淀两次。于 -80℃，在 75％ 乙醇内无限期保存。
16. 4℃，12 000 g 离心 15 min。吸掉上清，空气中晾干。用 DEPC 处理过的水重溶 RNA 到浓度约 1 mg/ml。取1 ul 加入 100 ul 50 mmol/L NaOH 中读取 A260 数值， 确定 RNA 浓度。
17. 在 Microcon YM-100 过滤管内以 500 g 离心浓缩到浓度＞7 mg/ml， 如有必要可测定浓缩率。
18. 用分光光度法测定浓缩后 RNA 样品的浓度。保存于 -80℃。
19a. 若用固定化的 oligo-dT 引物：将引物与 RNA 在下面 17 ul 反应体系里复性（使用 0.2 ml 薄壁 PCR 管，以便温育过程可以在热循环仪上进行）：
19b. 若用 oligo-d （T）12-18 引物：将引物与 RNA 在下面 17 反应体系里复性（使用 0.2 ml 薄壁 PCR 管，以便温育过程可以在热循环仪上进行）：
20. 65℃ 加热 10 min，冰上放置 2 min。
21. 准备含有下列组分的母液（总体积 23 ul）：
8 ul 5×第一链缓冲液
4 ul 10×低 T 的 dNTP 混合液
4 ul 1 mmol/L Cy5 或 Cy3 标记的 dUTP
4 ul 0.1mol/L DTT
1 ul 30 U/ul RNasin
2 ul 200 U/ ul Superscript II
22.每管样品加入 23 ul 含有 Cy5-dUTP 或 Cy3-dUTP 的反应混合液。吹吸混匀，快速离心使溶液集中在管底。
23. 42℃ 温育 30 min， 再次加入 2 ul Superscript II。确保酶在反应体系里充分混匀， 再在 42℃ 温育 30～60 min。
24. 加入 5 ul 0.5 mol/L 的 EDTA （pH 8.0）终止反应。
25. 加入 10 ul 1mol/L NaOH， 在 65℃ 温育 60 min 以降解残余的 RNA。冷却至室温。此步骤所用氢氧化钠的纯度至为关键。轻微的污染或长期储存于玻璃容器会造成这种溶液可以降解 Cy5 分子，并使溶液变黄。有些研究者把水解时间减少到 30 min 而得到较好的效果。
26. 加入 25 ul 1 mol/L 的 Tris-Cl （pH 7.5）中和溶液。
27. 将标记的 cDNA 和 400 TE缓冲液（pH 7.5）Microcon YM-100 柱子里，吹吸混匀。室温 500 片用 10min 以脱盐。
28. 再次加入 200 ul TE 缓冲液（pH 7.5）洗一次， 到大约 20～30 ul （500 g 约 8～10 min）。
29. 把柱子倒转放入另一个干净的收集管，室温 500 g 离心 3 min 以回收 cDNA。
有些情况下，Cy5 标记的 cDNA 在浓缩管中会形成胶状的蓝色沉淀。看到这种东西意味着有污染。污染越严重，cDNA 被胶吸附的比例越高。即使加热溶解了，这种东西也是倾向于不加识别地与靶 DNA 非特异结合。
30. 取 2～3 ul Cy5 标记的 cDNA 检测，剩余的 18～28 ul 用作杂交。
31. 用标记的探针跑 2％ 琼脂糖胶检测，用 TAE 缓冲液。为了使胶的荧光分析达到最大的灵敏度，跑胶时只加入最少的染料，胶里或缓冲液中都不要加溴化乙锭。
32. 用 Molecular Dynamics 的 Storm 突光扫描仪扫描胶（参数：红色荧光，20 um 分辨率， 1000V on PMT）。参见图 1 看典型的标记成功（A 泳道）和失败（B 泳道）的例子
图1 Cy5 标记的 cDNA 在 2％ 琼脂糖电泳后的荧光扫描。
收起
注意事项
除有特别说明，所有溶液需用无RNA酶的水（如 DEPC 处理过的水）配制。
其他
1. 材料
从组织培养收获的细胞,在组织培养中的细胞，冻存的整个组织
2. 试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）
TRIzol 试剂（Life Technologies） 氯仿
100％、75％ 和 70％ 乙醇
Rneasy 大规模试剂盒（Qiagen）内含：
50 ml 大规模离心柱和收集管
RW1 缓冲液 RPE 缓冲液
DEPC 处理过的水（试剂盒附带）
3 mol/L 乙酸钠，pH 5.2
2 mg/ml 固定化的 oligo-dT 引物（固定的：5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV N－3’；如 Genosys 公司）
1 mg/ml d （T） 12－18 （Amersham Pharmacia Biotech）
10×低 T 的 dNTP 混合液
1 mmol/L Cy 3-dUTP 或 Cy 5-dUTP，保存于 -20℃，对光敏感。
RNasin RNA 酶抑制剂（Promega）
Superscript II 逆转录酶试剂盒，无 RNA 酶 H，带有 5×第一链缓冲液和 1 mol/L DTT （Life Technologies）
0.5 mol/L EDTA
1 mol/L NaOH
1 mol/L Tris-Cl， pH 7.5
TE 缓冲液，pH 7.5
1 mg/ml 人 C0t－1 DNA （Life Technologies）
2％（m/V）琼脂糖胶（宽 6 cm×长 8.5 cm， 孔宽2 mm）溶于TAE 缓冲液
50×TAE缓冲液
3. 耗材
组织匀浆器（如 Brinkmann Instruments 的 Polytron PT 1200）
15 ml 圆底聚丙烯离心管
50 ml 圆锥聚丙烯离心管
有水平转头可离心 50 ml 圆锥离心管的临床离心机
1.5 ml 微量离心管
离心过滤管（如 Amicon 公司的 Microcon YM－100）
0.2 ml 带盖薄壁 PCR 管
热循环仪
荧光扫描仪（如 Molecular Dynamics 用于凝胶分析的 Storm 系统）
