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动物病毒的鸡胚培养实验

2020.8.18

实验方法原理

本实验用痘苗病毒和鸡新城疫病毒接种鸡胚。痘苗病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长,经培养后,产生肉眼可见的白色痘疱样病变,似小结节或白色小片云翳状。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内,生长后,鸡胚全身皮肤出现出血点,以脑后最显著。
实验材料 痘苗病毒(Vavvinia virus)鸡新城疫病毒(Newcaatle distase virus)白壳受精卵

试剂、试剂盒 2.5% 碘酒70% 乙醇

仪器、耗材 孵卵器检卵灯齿钻磨壳器钢针蛋座木架注射器镊子剪刀封蜡灭菌培养皿灭菌盖玻片

实验步骤

1. 准备蛋胚

孵育前的鸡卵先用清水以布洗净,再用干布擦干,放入孵卵器内进行孵育(37℃,相对湿度是 45~60%),孵育 3 d 后,鸡卵每日翻动 1~2 次。孵至第 4 d,用检卵灯观察鸡胚发育情况,未受精卵,只见模糊的卵黄黑影,不见鸡胚的形迹,这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影,比较大一些的可以看见胚动,随后每日观察一次,将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者,即可能是已死或将死的鸡胚,要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前,具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

2. 接种

2.1 绒毛尿囊膜接种

2.1.1 将孵育 10~12 d 的蛋胚放在检卵灯上,用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。

2.1.2 用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处,并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形(每边约 5~6 mm)的小窗,不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。

2.1.3 用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳,露出壳下的壳膜,在壳膜上滴一滴生理盐水,用针尖小心地划破壳膜,但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜,此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜,以利两膜分离。

2.1.4 用针尖刺破气室小孔处的壳膜,再用橡皮乳头吸出气室内的空气,使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室(图 1)。

A. 接种前的准备;B. 接种后鸡卵的状态

2.1.5 用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0.05~0.1 ml 痘苗病毒液于绒毛尿囊膜上。

2.1.6 在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡,作成堤状,立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口,则将卵壳盖上,接缝处涂以石蜡,但石蜡不能过热,以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行 37℃ 培养,48~96 h 观察结果。

温度对痘苗病毒等病灶的形成影响显著,应严格控制培养温度在 37℃,高于 40℃ 的培养温度,鸡胚不能产生典型病灶。

2.2 尿囊腔接种

用孵育 10~12 d 的蛋胚,因这时尿囊液积存得最多。

2.2.1 将蛋胚在检卵灯上照视,用铅笔画出气室与胚胎位置,并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。

2.2.2 将蛋胚竖放在蛋座木架上,钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳,并用钢针在记号处钻一小孔。

2.2.3 用带 18 mm 长针头的 1 ml 注射器吸取鸡新城疫病毒液,针头刺入孔内,经绒毛尿囊膜入尿囊腔,注入 0.1 ml 病毒液(图 2)。

2.2.4 用石蜡封孔后于 37℃ 孵卵器孵育 72 小时。

2.3 羊膜腔接种

2.3.1 将孵育 10~11 d 的蛋胚照视,画出气室范围,并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。

2.3.2 用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形,每边约 1 cm 的裂痕。

2.3.3 用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜,并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上,使其透明,以便观察,若将蛋胚放在检卵灯上,则看得更清楚。

2.3.4 用灭菌尖头镊子,两页井拢,刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方,并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来(图 3)。

图 3 羊膜腔接种

23.5 左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜,右手持带有 26 号针头的注射器,刺入羊膜腔内,注入鸡新城疫病毒液 0.1 ml。针头最好用无斜削尖端的钝头,以免刺伤胚胎。

2.3.6 用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住,于 37℃ 孵卵器内孵育 48~72 小时,保持蛋胚的钝端朝上。

鸡胚接种病毒的操作过程及使用器械应严格无菌,尽可能在无菌工作台上进行。

3. 收获

3.1 绒毛尿囊膜

3.1.1 用碘酒消毒人工气室上的卵壳,去除窗孔上的盖子。

3.1.2 将灭菌剪子插入窗内,沿人工气室的界限剪去壳膜,露出绒毛尿囊膜,再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起,用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下,放入加有灭菌生理盐水的培养皿内,观察病灶形状。然后或用于传代,或用 50% 甘油保存。

3.2 尿囊腔接种法收获尿囊液

3.2.1 将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜,使血管收缩,以便得到无胎血的纯尿囊液。

3.2.2 用碘酒消毒气室处的卵壳,并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜,翻开到卵壳边上。

3.2.3 将鸡卵倾向一侧,用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获 6 ml 左右尿囊液,收获的尿囊液暂贮 4℃ 冰箱,经无菌试验合格后于 -30℃ 长期贮存。

3.2.4 观察鸡胚,看有无典型的症状。

3.3 羊膜腔接种法收获羊水

3.3.1 按收获尿囊液的方法消毒、去壳,翻开壳膜和尿囊膜。

3.3.2 先吸出尿囊液。

3.3.3 再用镊子夹出羊膜,以尖头毛细吸管插入羊膜腔,吸出羊水,放入灭菌试管内,每蛋胚可吸 0.5~1.0 ml。经无菌试验后,保存于低温中。

3.3.4 观察鸡胚的症状


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