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超分辨率显微镜发展历程和技术原理

2020.2.28

超分辨率显微镜发展历程

毫无疑问，自16世纪以来，光学显微镜已经历漫长的旅程。首次被知晓的复合显微镜是由Zacharias和Hans Janssen构造的。尽管这些显微镜没有保存下来，但人们确信这些显微镜已能够将放大倍率从3倍提高到9倍。17世纪末期，Leeuwenhoek首次将放大倍率和分辨率提高到细胞水平。他存留下来的显微镜有275倍的放大倍率和令人震惊的1μm分辨率。在19世纪晚期，Ernst Abbe发现光学显微镜的分辨率是由入射光波长和显微镜数值孔径的函数关系决定的。这一发现使分辨极限达到220nm左右。在之后的约100年内，显微镜学家始终停留在这一分辨极限。空间分辨率的限制排除了光学显微镜分辨亚细胞结构如核糖体、囊泡以及其他分子相互作用的可能性，这些物质尺寸均在光学显微镜的分辨能力之下。

20世纪30年代后期，德国科学家Ernst Ruska发明了电子显微镜，它的出现并不久，而Max Knoll推动其分辨率极限低至10埃左右。这是一个不可思议的壮举。不几年后，生物学家就开始利用这种新型的工具。1945年3月，Keith Porter, Albert Claude和Ernest Fullam 在论文“电子显微镜用于组织培养细胞的研究”中发表了第一张单个细胞的电子显微镜照片，文章发表在Journal of Experimental Medicine上。接下来的几十年涌现出大量由生物学家利用TEM揭示详细和复杂超微结构的实验工作。

然而，生物显微镜的目的是了解细胞存活时如何发挥机能。“细胞生命”则是科学家为得到TEM惊人分辨率所需付出的代价。细胞样品要求被固定、脱水、包埋于塑型剂并切成超薄切片。这就产生了一个高度加工和最终长时间操作的样品的二维图像。我们花了很长时间寻找合适的固定剂和缓冲剂，以最大限度地减少人工操作。同样，利用超薄连续切片，目前三维的细胞重构也成为可能，但数据仍然仅呈现一个快照的时间。而生命是动态的，它的周期超过一个快照的时间。

接下来这一领域出现了超高分辨率显微镜。为充分认识动态生命进程，我们需要推进光的分辨率极限，并将荧光和共聚焦成像的先进技术应用于亚细胞水平。我们需要能够应用于活细胞的更高分辨率。1978年，兄弟Thomashe和Christopher Cremer两人在Microscopia Acta上发表了“对具有高分辨率和穿透深度的激光扫描显微镜的思考”。文章中的观测数据开启了在光的衍射极限之下的观测的大门。

超高分辨率显微镜的代表技术包括：STED,PALM,STORM,SIM；所有主要的显微镜供应商，如莱卡、蔡司和尼康，均提供商品化超分辨率显微镜部件，分辨率低至20纳米并非罕见的要求。即使是规模较小运营不久的公司，如犹他州的Vutara，号称有第一款3D超分辨率显微镜，也进军这一领域。这一分辨水平的活细胞成像变的十分普遍，在大量文献中都能看到。

超分辨率显微镜技术原理、荧光抗体

1873年，德国医师Ernst Abbe 提出了“衍射极限”的概念。他预测，由于光的基本衍射性质，光学显微镜无法实现200nm以下的分辨率。实际上，当两个相隔很近的物点同时发光时，得到的图像是模糊的，无法分辨。超分辨率显微镜（SRM）的诞生打破了一个世纪多以来一直被认为无法突破的瓶颈。

如今，科学家们已经研发了多种超分辨率技术，远远超出了衍射极限，能够观察到分子尺度的细节。SRM技术可以将细胞结构解析为亚细胞水平，从而获取有关细胞组分的3D结构的信息，并可以观察到单分子共定位。

以下概述了时下几种最流行的SRM技术的原理：

1.受激发射耗竭（STED）显微镜

STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单，该方法和普通共聚焦显微镜（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用单光源，而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签（研究者们以此来定位和观察蛋白）的光，另一个光源发出不同波长的光，用于抑制荧光。这束光是环形的，并且与第一束光有所重叠，因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

获得STED超分辨率图片并没有那么复杂，用户需要仔细调整参数，才能得到漂亮的结果，否则所得图片和普通confocal没有差别。

使用传统和RESCue受激发射减损显微镜（STED）得到的细胞核膜上核孔复合体的图片

STED的原理：

显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域，这称为点扩散函数（PSF）（见图1），由于PSF的存在，使得常规显微镜无法达到超分辨。

图1：在普通光学显微镜中，成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制，防止了射线的精确会聚，从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数（PSF）的大小，或对象在某个点的三维强度分布。在STED中，应用环形炸弹耗尽型激光器，其零点与激发激光焦点的最大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”，从而“抑制了来自零点附近区域的荧光，导致有效PSF的尺寸减小”。

而受激发射耗竭（STED）显微镜通过限制样品的荧光区域（PSF）产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光，第一个按照常规显微镜激发荧光团（图2A）。第二个激光器称为耗尽激光器（STED激光器），它激发“甜甜圈”形状的激光，其中心的零强度点非常小（?30 nm）（未激发）。除了在甜甜圈的中心处之外，第二激光起到了“关闭”第一激光所产生的外圈荧光，从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处，这有效地降低了PSF，以产生非常小的单分子荧光聚焦区域，从而获得高分辨率图像（图2D）。

图2：

单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析，从而导致图像模糊
STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”
饱和耗尽在功能上降低了激励PSF
随之可以解析单个蛋白质

适用于STED的荧光团偶联抗体：

为了获得超分辨率，染料必须具有STED激光波长的高发射截面，并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性，具有高的量子产率和对比度，并在目标附近具有足够的标记密度。

Jackson提供荧光染料标记的二抗，下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用： AlexaFluor?488（如：115-545-003），FITC（如：715-095-150），AlexaFluor?594（如：715-585-151）和AlexaFluor?647。

2. 随机光学重建显微镜（STORM）

最有名的“基于探针”的技术是Betzig等人研发的光激活定位显微技术（photoactivated localization microscopy, PALM）和哈佛大学庄小威实验室发明的随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签，随后使用另一束光来关闭这些荧光标签。不断重复这个过程，生成一系列部分荧光图，最后重建成整个视野的荧光图。，以产生分辨率优于常规方法收集的图像。

使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

Jackson提供适用于dSTORM应用的标记二抗，简而言之，较低强度的激发光激发样品，随机激活少量染料分子。单个发荧光的染料分子足够分散，因此可以计算其点扩散函数的中心，从而推断出染料的确切位置。然后使用第二激光关闭所有分子，并重复该过程。然后，通过重叠每种染料的所有映射点扩展函数，以数学方式生成高分辨率图像。

用于单分子定位实验的荧光团偶联抗体

用于单分子定位的最佳染料通常非常亮，并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多种广谱范围内的可靠染料，例如AlexaFluor 488，AlexaFluor 647和Cy 5，可用于这些类型的实验。

建议用于超分辨率显微镜的荧光染料偶联物：