小分子RNA（miRNA）简介
一、什么是小分子RNA（ MicroRNA）?
MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为20-24个核苷酸长度的具有调控功能的非编码RNA。 miRNA
主要参与基因转录后水平的调控。这些miRNA基因首先在细胞核内转录成原始miRNA转录本（primary transcripts
miRNA,pri-miRNA），在核糖核酸酶Drosha的作用下剪切形成约60-70nt
的发卡状miRNA前体（或者称为pre-miRNA），然后Ran-GTP /Exportin
5将pre-miRNA转运到细胞质，随后，另一个核糖核酸酶Dicer将其剪切成约为20-24个核苷酸长度的miRNA
:miRNA双链。这种双链很快被载入RNA诱导沉默复合体（RISC）中，之后其中一条单链miRNA被降解，另一条成熟的单链miRNA分子通过与靶基因的3’UTR区互补配对，对靶基因进行降解或者翻译抑制。
二、miRNA的特点
1． miRNA 在反复冻融，PH改变，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的稳定性。
2． 相同的miRNA在不同细胞、不同组织器官以及不同种属之间具有相似的序列以及调控功能。
3． miRNA在不同组织、不同细胞间的表达谱表现特征不同，因此miRNA表达谱可以作为某些组织或细胞的特异性分子标志。
4． miRNA的组成在细胞的不同发育阶段不同，特定的miRNA在特定细胞的特定阶段出现，决定细胞的分化方向和分化时相，因此miRNA是细胞定时、定向分化的开关。
5． miRNA的调控不是一一对应的，而是同时调节一组功能相似或相近的蛋白。
6． miRNA的调控力度不是很强，一般仅占蛋白表达量的30%或以下。
三、为什么miRNA会成为研发热点？
1． 作为生物标志物
首先，miRNA在不同组织，不同细胞以及细胞的不同发育阶段组成不同，是“天生的”良好标志物；其次，miRNA
稳定性甚佳，在反复冻融、PH改变、DNA以及RNA裂解酶的作用下都不容易降解，比较容易获得；
还有，miRNA的调控为一控多，这也决定了miRNA的数量不会太多，最新数据显示人体内发现的miRNA总数为1048条。综上所述，miRNA具备了很多优质生物标志物所应具备的特点。
2． 作为潜在药物靶点
由于miRNA是通过对一组功能相似的蛋白进行温和调控以达到功能调控的目的，因此通过阻断miRNA来调控生理功能理论上对于生物体本身会相对安全。因此miRNA是很好的潜在药物靶点。
3． 作为基础研究对象
通过对miRNA功能的研究，可以把蛋白质按照功能重新分类，从而可以发现一些已发现蛋白的新功能，并与新的信号通路联系起来，推动基础科学研究的进步。
四、miRNA的检测方法
1. 深度测序 (Deep Sequencing)
深度测序是一种最新的高通量测序技术，它一次可以同时对几十万至几百万条DNA进行测序。深度测序可以对一种生物、组织或细胞器进行基因组、转录组或代谢组进行全面、深入、细致的分析。通过深度测序技术，我们可以对未知的miRNA进行探索发现，对已知的miRNA进行初步的定性半定量分析。
2. 基因芯片（Micro-Array)
基因芯片技术兴起于20世纪90年代，它是一种快速的、高通量的通过核酸杂交反应的原理来测定基因表达量的技术。基因芯片技术的出现使得对成千上万基因表达同时进行检测成为可能。近年来随着miRNA研究逐渐成为热点，用于检测miRNA的芯片产品也越来越多。该技术最主要的优势为具有极高的检测通量，同时检测成本较低。但是由于技术本身的限制，基因芯片只能显示出2倍以内的表达差异，因此也是属于定性半定量检测技术。
3. 实时荧光定量PCR (Real-time qPCR)
实时荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied
biosystems公司推出在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。该技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA
(或cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA (或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。
目前市场上miRNA qPCR检测方法主要有以下两种：1. 两步法； 2.三步加尾法。两种方法的主要差别在于qPCR之前的
cDNA制备过程（如图）。其中两步法是通过独特设计的茎环结构引物进行反转录将miRNA反转录成cDNA。而三步法则是给miRNA序列加polyA尾，之后再利用反转录过程将miRNA反转录成cDNA并加上独特设计的尾部序列。
两步法的优势在于特异性很高，但是最新的研究报道显示在编辑过程中，miRNA
的3’序列的多样化现象(Heterogeneity)，这种现象的发生使得目前市场上qPCR两步检测法的准确性受到影响（如图）。而三步法则不受这一现象的影响，而且随着科学家们的不断摸索创新，三步法的特异性如今已经可以和两步法媲美。更重要的是低廉的价格也是三步检测法越来越受到广大研发人员喜爱的重要原因。五、miRNA的应用举例
1． 免疫学应用 （T/B 淋巴细胞）
研发人员监测大量已知miRNA在免疫反应中表达的变化， 从而发现其在生理病理状态下的重要作用。除此之外研发人员还可以发现和鉴定出新的生物标志物，从而达到监测免疫细胞的信号转导和组织器官的分化的目的。
2． 干细胞领域的应用
由于miRNA细胞特异性以及“时空”特异性的特点，近年来其在干细胞定向分化和自我更新功能维持中的作用，逐渐被科学家们发现。通过监测大量已知miRNA在免疫反应中表达的变化，研发人员可以在较短的时间内发现新的干细胞分化的标志miRNA；
此外通过对已知的miRNA标志物表达量的检测，可以达到对干细胞的多能性以及分化进行监测的目的。
3． 癌症领域的应用
根据国内外的相关报告，某些miRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。
根据miRNA在人体中起到的调节蛋白生成的特殊作用，我们认为其在未来临床检测应用方面具有广阔的前景。
