多功能酶标仪测定荧光强度
HSC-T6、Dulbeceo’s Modafied Eagle’s Medium(DMEM, Sigma);新生小牛血清(杭州四季青公司);Hoechst33258 (Sigma);MTT、JC-1和DMSO(Sigma);次氮基三乙酸铁(Fe-NTA, Sigma);其余为国产分析纯试剂。GS由新疆特种植物药资源教育部重点实验室提供。
细胞接种于细胞培养瓶,药物处理24 h,胰蛋白酶消化,PBS润洗,液氮反复冻融,以破碎细胞膜。加入新的PBS,在4 ℃、10 000×g下离心15 min。取上清液用PBS稀释,制成样品溶液。运用邻苯酸酚自氧化速率法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。
1.1 试剂及细胞株
【关键词】 甘草总黄酮;石见穿总酚酸;肝星状细胞;凋亡;线粒体膜电位
1.10 荧光探针JC-1测定线粒体膜电位
1.9 荧光染料Hoechst33258测定细胞凋亡
HSC-T6用含10%小牛血清的DMEM培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。传代后培养8 h即可贴壁生长;2 d后细胞80%～90%铺满瓶底,牙周科论文发表,即可再次传代,传至3～4代,用于实验。
对数生长期的HSC-T6用含10%新生小牛血清的培养液吹打成单细胞悬液,以每孔5×104个细胞接种到96孔培养板,置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。细胞贴壁率达到70%后药物处理,继续培养48 h。最后每孔加MTT溶液20 μL(5 mg/mL),孵育4 h,终止培养,吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μL的二甲基亚砜(DMSO),振荡10 min,使结晶物充分融解。选择490 nm波长,多功能酶标仪测定OD值。
肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是慢性肝病的共同病理学基础,其中25%～40%最终发展为肝硬化甚至肝癌 [1]。目前认为,口腔工艺毕业论文,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是HF细胞外基质的主要来源细胞,HSC的活化和功能的改变是HF形成的关键[2-3],也是抗纤维化研究的核心。越来越多的实验表明,氧化应激是不同原因引起的HF发生的共同通路。实际上,铁负载、乙醇、四氯化碳和丙型肝炎病毒等引起HF的病因都可通过氧化应激和脂质过氧化途径激活HSC。Iredale等[4]的实验表明,激活的HSC主要不是通过转化为静止的HSC实现的,也并非引起坏死,因为纤维间隔及其邻近区域没有坏死及炎症的表现,而是凋亡的结果。在急性或慢性肝损伤修复的动物模型中也发现了HSC的凋亡。由激活的HSC分泌的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的表达减少,解除了对胶原酶活性的抑制使胶原降解增加,再加上HSC的减少使细胞外基质的分泌减少,两个原因使细胞外基质降解[4-6]。那么,有针对性地诱导人HSC 发生凋亡为HF的治疗提供了实际目标。本课题建立大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的氧化应激模型,着重研究抗氧化剂甘草总黄酮与石见穿总酚酸联合用药(GS)能否促使氧化应激的HSC凋亡,口腔科论文发表,并探讨凋亡是否与线粒体凋亡途径有关。
多功能酶标仪(Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH);AR-2140型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司制造);CO2培养箱(Forma 3110,USA);蔡司荧光倒置显微镜。
Key words：Glycyrrhiza uralensis;salvianolic acid;hepatic stellatecells;apoptosis;mitochondria membrane potential
对数生长期的HSC-T6经0.25%胰蛋白酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM 培养液调整为单细胞悬液并接种于细胞培养瓶,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后细胞贴壁良好,换用含0.2%胎牛血清的DMEM培养,使其生长同步化。当细胞贴壁率达到70%后,更换培养液并加入不同浓度的Fe-NTA (0.1、0.5、1 mmol/L)。
1.5 氧化应激模型的建立
1.2 仪器
Fe-NTA处理贴壁良好的HSC-T6 6 h,加GS处理4 h,胰蛋白酶消化,收集细胞到离心管内,PBS润洗,离心,重复2次。加DCFH-DA至96孔板,终浓度为30 μmol/L,终体积为200 μL,继续孵育30 min后,PBS润洗2次,于多功能酶标仪测定荧光强度,激发光为485 nm,发射光为520 nm[7]。
1 材料与方法
1.6 肝星状细胞丙二醛含量的测定
1.3 细胞培养
1.8 细胞内活性氧的测定
【摘要】 目的 研究甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用对氧化应激的肝星状细胞(HSC)的促凋亡作用。方法 MTT法检测甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)增殖的影响。次氮基三乙酸铁与HSC-T6体外共培养建立氧化应激模型,采用TBA法检测细胞内丙二醛(MDA)含量,运用邻苯酸酚自氧化速率法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧水平。荧光染料Hoechst33258观察细胞的形态及凋亡情况。JC-1检测细胞内线粒体膜电位变化情况。结果 甘草总黄酮与石见穿总酚酸联合处理HSC-T6后,细胞的增殖受到抑制,并促进HSC-T6凋亡;细胞内线粒体膜电位下降;随着药物剂量的增加细胞内活性氧含量下降。结论 甘草总黄酮与石见穿总酚酸联用促进氧化应激的HSC凋亡,此作用可能与线粒体凋亡途径有关。
Fe-NTA处理贴壁良好的HSC-T6 6 h,加GS处理4 h,胰蛋白酶消化,收集细胞于离心管内,PBS润洗2次,加入JC-1,37 ℃避光孵育20 min。PBS润洗1次,离心,弃上清。PBS重新混悬细胞,移液枪将适量细胞滴于载玻片上,口腔医学技术论文,盖上盖玻片,于荧光倒置显微镜下观察、拍照。
细胞发生凋亡时,染色质会固缩,Hoechest33258染色后,在荧光显微镜下观察,正常细胞蓝色,而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。染液配成100 μg/mL。临用时,稀释为终浓度10 μg/mL。细胞悬液(含3～5×106细胞)1 000×g、40 ℃离心5 min,口腔溃疡论文。将上清弃去,细胞于30～50 μL 40%(W/V)多聚甲醛中悬浮,细胞涂片干燥,将10 μg/mL Hoechst33258染液滴于载玻片上,避光放置10 min。将玻片侵入蒸馏水中5次进行冲洗,避光干燥。用PBS/甘油粘片,用绿色滤光片在荧光倒置显微镜下观察。
细胞接种于细胞培养瓶,药物处理24 h,胰蛋白酶消化,PBS洗涤,离心,收集细胞。取细胞悬液适量,采用TBA法检测细胞丙二醛(MDA)含量。
1.7 肝星状细胞内超氧化物歧化酶活性的测定
Abstract：Objective To investigate the effect of Glycyrrhiza uralensis flavonoids and salvianolic acid (GS) on the apoptosis of HSC-T6 cells. Methods HSC-T6 were incubated with ferric nitrilotriacetic acid (Fe-NTA), SOD activity and MDA content in HSC-T6 were detected. MTT colorimetric method and trypan blue staining were used to measure the cell proliferentiation and survival rate. Production of reactive oxygen species (ROS) of drug-treated cells were monitored by a fluorescent probe 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin fluorescence (DCFH-DA). Morphological changes associated with apoptosis were examined by staining with Hoechst33258. Moreover, changes in mitochondrial transmembrane potential were determinde by the dual-emission potential-sensitive probe 5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1). Result Oxidative stress decreased the activity of SOD in HSCs, increased the content of MDA in HSC-T6. GS inhibited the cells proliferation and decreased the iROS levels in a dose dependent manner, After 24 hours treatment with GS, the typical apoptic morphology was found in HSCs, including the decrease of karyoplasmic ratio and the increase of kidney-shape nuclear cells. Furthermore, GS induced a concentration decrease in ROS production and in mitochondrial membrane potential. Conclusion GS play an important role in oxidative stress HSC-T6 apoptosis which may be corrected with mitochondria apoptosis pathway.
1.4 MTT法测定细胞活力
