基于碳纳米管修饰电极的胆碱电化学发光生物传感器研制
电化学发光（ECL）分析法由于其可控性好、灵敏度高、选择性好、仪器简单等优点已成功应用于环境科学、生命科学和材料科学等领域。鲁米诺是常用的发光试剂，它具备很好的发光性能，尤其是对活性氧有良好的响应，可作为酶催化反应的信号输出，以研制ECL生物传感器〔1～3〕。诸多酶催化反应的产物为H2O2，可以通过H2O2对鲁米诺ECL的增敏作用实现生物传感，将ECL的高灵敏度与酶反应的高选择性结合，具有极好的应用前景。
胆碱是中枢神经系统重要的神经递质乙酰胆碱的前体〔4〕，在临床检验中，它被用作为如帕金森氏症和阿尔茨海默氏病脑组织胆碱功能活性的标志物〔5～7〕。胆碱缺乏被认为可能是这些疾病诱因之一，目前胆碱也被列为安全的食品添加剂。测定胆碱常用方法有生物测定方法、氢火焰气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱法等〔8〕。近年来开发了多种分析胆碱的生物传感器，Hsieh等〔9〕利用几丁质，将胆碱氧化酶（ChOx）共价固定于铂电极表面，用于分析胆碱浓度，检出限为10.0 SymbolmA@ mol/L， Garguilo等〔10〕制备了选择性监测大鼠脑胞外微摩尔浓度胆碱的微型安培传感器。固定ChOx的方法有多种，是影响其催化活性及稳定性和灵敏度的因素〔11〕。ChOx可通过聚乙烯醇低温凝胶膜〔12〕、含普鲁士蓝的碳糊〔13〕及辣根过氧化物酶，共同固定于透析膜支撑的碳糊〔14〕等方式固定于电极表面。碳纳米管（CNTs） 〔15〕由于其高导电性、强吸附性、良好的机械强度和优良的生物相容性，已成功应用于生物分子的组装〔16〕。
本研究报道了基于碳纳米管修饰电极和鲁米诺ECL的胆碱生物传感器，其酶催化反应可描述为〔17〕：
Choline＋O2Betaine aldehyde＋H2O（1）
作为一种有效的ECL增强剂〔18〕，酶催化反应所产生的H2O2增强了鲁米诺的ECL强度。基于此原理，本研究组研制了测定乳酸〔19〕、谷丙转氨酶〔20〕和尿酸〔21〕的ECL生物传感器。在这些研究中，分别对CNTs和K3Fe（CN）6在ECL生物传感器中的重要作用进行了探讨，CNTs有效提高了电极表面的生物相容性和电荷传输能力，提高了电极表面对酶及其它化学分子的固载能力；K3Fe（CN）6则不仅对酶的活性有很强的激活作用，同时对H2O2增敏的鲁米诺的ECL具有增强作用〔22〕，有利于提高所研制生物传感器的检测灵敏度。与文献〔23〕报道的胆碱生物传感器的线性下限5×10－7mol/L比较，本研究中的胆碱ECL生物传感器的定量下限和检出限分别为1×10－7mol/L 和1.21SymboltB@ 10－8mol/L，表明本传感器具有更好的灵敏度。人血清中胆碱的生理浓度约为6～7 SymbolmA@ mol/L（约0.7 mg/L）〔24〕，本传感器可望应用于此类样品的实际检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
由外部脉冲发生器提供信号的BAS-100A电化学分析仪（Bioanalytical System Inc.公司）作为电化学发光研究的脉冲恒电位源，三电极系统的工作电极和辅助电极均为铂电极，Ag/AgCl电极为参比电极，所使用的电解脉冲为上限电位0.8 V、下限电位－0.3 V，周期2 s、占空比1∶10。实验室研制的以光电倍增管为感光元件的PMT-II型微弱光检测器用作ECL检测，ECL信号经放大后由A/D转换器转换成数字信号由电脑记录。鲁米诺和胆碱氧化酶（Sigma-Aldrich公司）。氯化胆碱（上海沪试化工有限公司）。多壁碳纳米管（直径<10 nm，长度0.5～500 SymbolmA@ m，含量＞95%, 深圳纳米港有限公司），碳纳米管经浓HNO3浸泡10 h、回流5～6 h, 纯化、开管并分离干燥后，超声分散制得固含量为0.33 g/L的二甲基甲酰胺（DMF）分散液。其他试剂均为分析纯。大鼠血样由苏州大学医学部提供。实验用水为二次石英亚沸蒸馏水。
2.2 传感器制备
铂电极用Al2O3打磨抛光，用水冲洗并干燥。滴加4 SymbolmA@ L 0.33 g/L CNTs分散液和2 SymbolmA@ L 0.1 mol/L K3Fe（CN）6的混合液，室温下蒸发至干，然后滴加含1.5 U的ChOx溶液,并待其蒸发至干。应用此ECL生物传感器测定胆碱，以含8×10－6mol/L鲁米诺的磷酸盐缓冲液（pH7.4）为测试底液，记录电极上的发光强度对溶液中胆碱的响应。作为对比，制备了未经CNTs修饰的传感电极。该对照电极的制备过程为在预备好的铂电极表面经浸泡吸附K3Fe（CN）6和ChOx。同时，对裸电极上产生的ECL进行研究，测定时, K3Fe（CN）6和ChOx均溶解于PBS缓冲液中。
2.3 样品预处理
将0.1%肝素钠抗凝的大鼠血液样本在6000 r/min离心10 min,分离得血清。血清样品稀释100倍后分为4份，其中1份用于胆碱的测定
其它3份加入胆碱标样,用于回收率测定。每次测定均取50 SymbolmA@ L样品注入1 mL PBS后进行ECL检测。
3 结果和讨论
3.1 K3Fe（CN）6在传感器响应中的作用利用紫外-可见吸收光谱研究了K3Fe（CN）6增敏鲁米诺ECL信号的机理，分别测定了K3Fe（CN）6、鲁米诺及混合溶液的紫外-可见吸收光谱（见图1）。K3Fe（CN）6与鲁米诺溶液混合后，其紫外-可见吸收曲线与混合前溶液吸收曲线的数学叠加有显著差异，位于210 nm左右的K3Fe（CN）6的吸收几乎消失，而鲁米诺的吸光度增加。实验表明，鲁米诺和K3Fe（CN）6混合时发生氧化还原反应，K3Fe（CN）6被还原，但K3Fe（CN）6 的氧化能力不足以将鲁米诺化学氧化至最终产物，只是将鲁米诺氧化至高能状态，因此鲁米诺的吸光性能增强；在施加电解能量时，鲁米诺更容易被氧化而产生更强的发光信号，此推理与K3Fe（CN）6增强鲁米诺与H2O2的化学发光反应的机理是一致的。
通常，鲁米诺的ECL以在碱性溶液中较强，而在中性及弱碱性条件下极弱，难于测定，这对研发基于酶催化反应的ECL生物传感器是不利的。研究发现，K3Fe（CN）6对鲁米诺ECL的增强作用在中性及弱碱性介质中尤为显著，在pH 6.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液中，ECL光强在pH＝8.0时达最大，基本满足ECL生物传感器的要求。
温度是影响反应速率的重要因素，在0～50℃范围内改变实验温度，ECL强度也随之变化，在30℃时，ECL光强最强。这是由于温度升高时，鲁米诺在电极上氧化生成鲁米诺自由基的反应速率增加，ECL增强；而温度更高时，自由基的热运动过于剧烈，导致自由基之间发生湮灭的机会增大，使得光强减弱。30 ℃为最佳测定温度，它同时也能够满足酶催化反应的要求。
3.2 测定条件优化
3.2.1底液pH值的影响 在含3×10－4 mol/L胆碱的磷酸盐缓冲液中，考察了溶液的pH值（pH 6.4～9.0）对此ECL生物传感器发光强度的影响。结果表明，电化学发光强度在pH 6.4～7.4之间逐步增加；pH＞7.4后, 发光强度下降，即pH 7.4为最佳测定酸度，此结果与文献〔25〕一致。对测试底液中鲁米诺的浓度进行了优化，考虑中等程度的背景和稳定的ECL信号，确定鲁米诺的最佳浓度为8×10－6 mol/L。
3.2.2 电极上CNTs/K3Fe（CN）6/ChOx修饰量的影响
如图2所示，修饰电极所用的6 SymbolmA@ L混合液中，0.33 g/L碳纳米管分散液和0.1 mol/L K3Fe（CN）6溶液的最佳体积比是2∶1，即修饰于电极表面的CNTs和K3Fe（CN）6分别为1.32 SymbolmA@ g和0.2 SymbolmA@ mol。
3.2.3 电极表面胆碱氧化酶的固载量的影响 酶的用量决定所研制的生物传感器的响应速率、性能及成本〔26〕。本电极表面胆碱氧化酶的固载量对H2O2的产生有显著影响，并影响鲁米诺的发光强度。图3表明，随着电极表面ChOx固载量（固定时所用酶量）的增加，发光强度先增强后降低，最佳固载量为1.5 U。本实验依靠酶分子和CNTs之间的作用实现酶的固定。当酶的固载量较低时，底物（胆碱）过量，酶浓度未达到饱和，此时酶促反应速率与酶浓度呈线性关系，因而产生的H2O2量与酶量成正比，表现为鲁米诺的ECL随酶固载量的增加而增强；当较多ChOx固载于修饰电极表面时，将造成酶修饰层的扩散阻力增加〔27〕，导致鲁米诺的ECL随之降低。
3.3 胆碱ECL生物传感器的分析性能
在优化条件下，本ECL生物传感器对胆碱的响应在1×10－7 ～4×10－3 mol/L浓度范围内线性相关（I＝0.42＋2.1×107CCholine），相关系数为0.994，图4b为在10－7mol/L浓度数量级范围内的响应曲线，按3S计算所得检出限（LOD）为1.21SymboltB@ 10－8 mol/L。与之相比，在未采用CNTs修饰制备的胆碱电化学发光生物传感器上，虽也能得到鲁米诺的ECL信号，该ECL信号与胆碱浓度之间也有线性关系，线性响应范围为5×10－7～2.1×10－4mol/L （I＝0.29＋2.2×106CCholine，LOD为1.37×10－7 mol/L），但由于只是通过吸附实现K3Fe（CN）6和ChOx在电极表面的固定，均不是十分稳定，故随着使用时间的延长，其响应快速下降，无法得到稳定的响应值，不能作为传感器使用。对比研究了裸电极在含K3Fe（CN）6、ChOx和鲁米诺的PBS缓冲液中的ECL响应，虽表现出对胆碱稳定的响应，但其响应极微弱（图4a）。上述结果表明，在经CNTs/K3Fe（CN）6修饰的Pt电极上固定ChOx制作ECL胆碱生物传感器，所得灵敏度（线性回归方程斜率）较未经CNTs修饰的生物传感器提高近一个数量级，检出限降低一个数量级，并具有良好的稳定性和重现性，对1×10－4 mol/L氯化胆碱连续6次测定的相对标准偏差（RSD）为3.6%。
3.4 干扰实验和样品测定
根据大鼠血清中可能存在的共存物质，通过测定在1×10－7 mol/L氯化胆碱溶液中加入潜在干扰物质所产生的响应评估生物传感器的抗干扰性能，以±10%相对误差作为外来物种不产生干扰的判据。结果表明，20倍抗坏血酸、30倍尿酸、50倍多巴胺、100倍乳酸、50倍Mg2＋和Ca2＋、100倍K＋和1000倍Na＋，肝素钠（抗凝剂），不干扰测定。
应用此ECL生物传感器检测大鼠血清中胆碱，测定结果为4.88 mg/L，以血清占全血55%计，可换算得血液中胆碱含量为2.68 mg/L，与大鼠血液中胆碱平均含量范围相符，测定结果和回收率见表1，平均回收率为101.1%。人血清中胆碱正常生理含量约0.7 mg／L，现有实验结果表明，用此传感器进行测定尚有数百倍的稀释容量，因此完全可以用于人血清样品的测定。
表1 大鼠血清中胆碱浓度的测定和回收率Table 1 Determination of choline in rat serum
4 结 论
在碳纳米管/K3Fe（CN）6修饰的铂电极上吸附ChOx，基于鲁米诺的电化学发光构建一种对胆碱有灵敏和选择性响应的ECL生物传感器，优化了传感器研制和检测的最佳条件。酶反应中产生的过氧化氢增强鲁米诺的电化学发光强度，可得到发光强度与溶液中底物胆碱浓度的线性关系。对所制备传感器分析性能进行了表征，并应用于大鼠血清中胆碱的检测。该传感器显示了对胆碱的快速响应并具有良好的稳定性和重复性，较宽的线性范围和低的检出限，为胆碱检测在医疗应用领域的潜在应用奠定了基础。
