蛋白质-DNA相互作用的甲基化和尿嘧啶干扰分析法—甲基化
| 实验方法原理 | 在甲基化干扰实验中，探针通过将鸟嘌呤N-7及腺嘌呤N-3位用硫酸二甲酯 (DMS)进行甲基化而产生。这些甲基化的碱基可被哌啶特异性切割。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | TE 缓冲液 pH 7.5 〜8.0硫酸二甲酯（DMS)DMS反应缓冲液DMS终止缓冲液10 mg mL tRNA 溶液0.3 mol L 乙酸钠1 mmol L EDTA pH 5. 21 mol L哌啶（从10 mol L哌啶储液稀释）终止 加样染液 仪器与耗材：水浴锅 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1) 制备单末端标记的DNA探针。 2) 取约106 cpm的探针溶于5〜10μL TE缓冲液中。加入200μL DMS反应缓冲液及 1μl DMS。在祸旋混合器上充分混匀。室温温育5 min。 注意：DMS是一种强毒性物质，必须在通风橱内小心操作。含有DMS的液体应倒在指定的 DMS废液瓶中，接触过DMS的吸液头应放入一个专门的DMS固体废物瓶中，由安全部门处理。 3) 在探针混合液中加入以下试剂：40μL DMS终止缓冲液、1μL 10 mg/mL tRNA 溶液、600μL 100% 乙醇。混匀后置于干冰/乙醇浴中10 min。微量离心机4℃以最大速度离心10 min。用延长的巴斯德吸管小心吸出上清，置于液体DMS废液瓶中。 4) 将沉淀重悬于250μL 0. 3 mol/L乙酸钠、1 mmol/L EDTA中，放置在冰上。加入750μL 100%乙醇，混匀，如步骤3 —样用乙醇沉淀DNA。 5) 按步骤4重复乙醇沉淀DNA 1次。用70%乙醇洗DNA沉淀1次，离心10 min。小心除去上清，将管子倒扣在吸水纸上，在空气中晾干10 min。 6) 在闪烁计数仪上测量DNA沉淀的契仑科夫计数，计算其cpm值。用TE缓冲液重 悬至约 20 000 cpm/μL。 7) 用优化的DNA结合条件，如同基本方案步骤9建立一个反应体系，但反应体积放大约5倍（50μL体积中用105 cpm探针）。 8) 将结合反应液加入3个非变性聚丙烯酰胺凝胶样品孔中。按迁移率变动分析法的条件对其进行电泳。 9) 将凝胶进行放射自显影，切出相应于蛋白质-DNA结合物及非结合探针的显影带，用电洗脱的方法从胶中将DNA纯化至DEAE膜上。 10) 用100μL 1 mol/L哌啶重悬沉淀。置于90〜95°C水浴中，在管子上加上一玻璃板以防盖子冲开。小心将管子从水浴中取出，置于干冰上。 11) 在盖子上用大注射器针头扎孔，在真空蒸发器（如Speed- vac)中冻干1 h或直至完全冻干。加100μL蒸馏水。再次冷冻和冻干。重复加水，冷冻和冻干。切伦科夫计数并测定样品的cpm值。 12) 在沉淀中加足够的终止/加样染液，浓度以1〜2μL体积中含有需加样的样品量为宜（3000 cpm足以自显影过夜）。95°C加热5 min，迅速置于冰上冷却。 13) 将非结合探针及蛋白质-DNA结合物加于6%或8%的聚丙验的烯酰胺/尿素测序胶上。同测序胶一样进行电泳及放射自干扰的鸟嘌呤和腺嘌呤用显影。加样的DNA-蛋白质结合物及非结合探针的计数值相等，以便对不同的样品进行精确的比较。 展开 |
