| 实验步骤 | 众所周知，在实验室内和实验室间难以保证双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的重复性。在我们实验室，强制性地要求严格遵守标准操作程序（sop ) , 以确保不同的操作者可以获得可重复的分离结果。小麦白面粉样品的 2D 胶图谱示例如图 16.1 所示。采用 Tris-CaCl2 提取法提取的并非“总蛋白”，而是小麦面粉中除谷蛋白之外的有代表性的蛋白样品。如果提取总蛋白，由于谷蛋白的含量很高，可能会掩盖掉其他较低丰度的蛋白质。同样的问题也可能发生在其他含有高丰度蛋白的组织中，尤其是绿色组织中存在的二磷酸核酮糖竣化酶（Rubisco) 。
我们提供了三种方法。第一种是以使用 Tris-CaCl2 提取为特征的提取法，在我们实验室被用于转基因（GM ) 与非转基因（non- GM ) 小麦的实质等同性的大规模蛋白质组学研究。第二种和第三种提取方法被广泛用于文献中，可适用于各种不同组织。
3.1 蛋白质提取
3.1.1 利用 Tris-CaCl2 缓冲液提取白面粉蛋白（参照 [ 11 ])
( 1 ) 2 g 白面粉加入 5 ml 预冷（4℃ ) 提取液，4℃ 搅拌 30 min。
( 2 ) 4℃，10000 g 离心 30 min，除去不溶物。
( 3 ) 保留上清于液氮中迅速冷冻，小份分装，储存于 -80℃，待用。
( 4 ) 用 Bradford 法测定蛋白质含量，以 BSA 作标准品。
3.1.2 酸 / 丙酮沉淀法提取白面粉或绿色组织蛋白（参照 [ 4 ] )
3.1.3 面粉
( 1 ) 在 50 ml Falcon 离心管中，悬浮 5 g 面粉于 20 ml 溶液 I 中，以最大速度涡旋 2 min，-20℃ 静置 1 h。
( 2 ) 4℃，15000 g 离心 10 min。
( 3 ) 弃上清，加 5 ml 溶液II 涡旋以重悬沉淀。
( 4 ) 4℃，15000 g 离心 10 min。
( 5 ) 重复步骤 3、4 两次。
( 6 ) 弃上清，在通风橱中，连续氮气流下干燥沉淀（确保无样品损失）。
( 7 ) 用 1 ml pH 适宜的复水缓冲液重悬 40 mg 干燥样品，涡旋 5 min，室温 13000 g 离心 10 min。
( 8 ) 保留上清，小份分装。在液氮中迅速冷冻。
( 9 ) 储存于 -80℃。
( 10 ) 用前测定小份样品的蛋白质浓度。
3.1.4 绿色组织
( 1 ) 使用预冷的研钵和研棒，液氮中研磨速冻的叶片。
( 2 ) 用 20 ml 溶液 I 悬浮 2 g 叶片粉末，以最大速度涡旋 2 min，-20℃ 沉淀 1 h。
( 3 ) 4℃，15000 g 离心 10 min，弃上清。
( 4 ) 加 5 ml 溶液II，涡旋重悬沉淀，4℃，15000 g 离心 10 min。
( 5 ) 重复步骤 4 两次，在通风橱中，连续氮气流下干燥沉淀，确保无样品损失。
( 6 ) 用 1 ml pH 适宜的复水缓冲液重悬 20 mg 干燥样品。
( 7 ) 涡旋 5 min , 室温 13000 g 离心 5 min。
( 8 ) 保留上清，小份分装。液氮中迅速冷冻，储存于 - 80℃ 备用。
( 9 ) 用前测定小份样品的蛋白质浓度。
如提取的蛋白中有叶绿素污染，可尝试 PEG/MgCl2 沉淀法（见注 3 ) 。
3.1.5 奥斯本分级分离法（ 参照 [ 12 ] )
( 1 ) 100 mg 面粉加 1 ml 水饱和正丁醇，室温下搅拌 1 h。
( 2 ) 室温下 5000 g 离心 10 min , 去上清。这是一个可选的步骤，用于“ 除脂”。
( 3 ) 抽提 “白蛋白/球蛋白” ：沉淀（来自步骤2 ) 加 1 ml 0.5 mol/L NaCl，室温下搅拌 1 h。如上述步骤离心，保留上清并重复抽提。
( 4 ) 合并上清，采用 5%（V/V）乙酸在 4℃ 充分透析 48 h，期间至少更换 4 次透析液，每次 5 L。
( 5 ) 抽提 “醇溶蛋白”：沉淀（来自步骤3 ) 加 1 ml 70%（V/V）乙醇室温搅拌 1 h。如前所述离心。保留上清并重复抽提。
( 6 ) 合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更换 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。
( 7 ) 抽提 “谷蛋白”：沉淀（来自步骤 5) 加 1 ml 50%（V/V）丙醇/2%（V/V）β-巯基乙醇/1%（V/V）乙酸，室温搅拌 1 h ( 注意：如有需要，可直接用 DTT 代替 β-巯基乙醇）。如前所述离心，保留上清并重复抽提。合并上清，5%（V/V）乙酸（至少更换 4 次，每次 5 L 溶液），4℃ 充分透析 48 h。
( 8 ) 透析后，冻干所有溶液。
( 9 ) 最终的沉淀（来自步骤 7 ) 可用 1 ml “总蛋白提取缓冲液” （IEF 复水液）提取：室温下混合抽提 1 h。如前所述离心，保留上清。分成小份，液氮中迅速冷冻，储存于 -80°C 。
3.2 等电聚焦（IEF)
各种长度（如 7 cm、13 cm、18 cm、24 cm ) 和不同 pH 范围的固定化 pH 梯度 ( IPG ) 胶条可供使用。IPG 胶条常在 20℃ 下（温度低于 20℃ 可导致尿素结晶）于适量水化液中水化过夜（16 h ) 。这可在溶胀托盘 （ re-sweling tray ) 或直接在胶条槽（stripholder) 内完成。无论选取何种方法，必须保证胶条和容器底部间的气泡都被移除。该步完成后，胶条需覆盖上不导电的油。如果水化是在溶胀托盘内进行的，还必须转移到胶条槽上运行。IEF 参数设置取决于胶条长度 ，但始终在 20℃ 完成。若温度高于 20℃，可能导致蛋白质修饰，如尿素产生的 氰酸铵（ammoniumcyanate) 导致的氨甲酰化 ( carbamylation ) 。一旦等电聚焦完成，沥去多余的覆盖油，储存胶条于 -80°C 。本说明假定使用的仪器是 GE Healthcare IPGphor。
胶条水化
( 1 ) 对于 24 cm IPG 胶条：融化 4 ml 水化液，加入 DTT 和 IPG 两性电解质至以下浓度：DTT 40 mmol/L；两性电解质 0.5%（V/V）。
( 2 ) 对于 pH 3~10 的 IEF，加入适量的样品至水化液中，使每根胶条上样 400 μg 蛋白质。理想条件下每根胶条须用 50~100 μl 样品。对于 24 cm 胶条，蛋白质样品和水化液的总体积应为 450 μl。理想条件下水化液：样品比例不应小于 3:1。
( 3 ) 无论水化是在 IPG Manifold ( 多功能盘）还是直接在单根胶条槽内进行，用移液器从 24 cm、12 道槽的溶胀托盘（reswelling tray ) 的槽一端加入 450 μl 缓冲液和蛋白质混合液（见注 4) 。
( 4 ) 对于 pH 6~11 间的 IEF，除了两性电解质以 pH 6~11 代替 pH 3~ 10 外，所用蛋白质和缓冲液的总体积与 pH 3~10 —样。此外，水化液是从槽一端加入，样品单独加在正极端（+ ) 。
( 5 ) 放置干胶条（ ImmobilineDryStrip )，胶面朝下，置于溶胀托盘的槽中，确保胶条下无气泡。
( 6 ) 用 DryStrip 覆盖油覆盖，加盖封上，20℃ 水化 16~18 h ( 过夜）。
( 7 ) 取走胶条（使用镊子），去除多余覆盖油。
( 8 ) 胶面朝上，放入 24 cm IPGPhor Manifold 多功能盘中（ 最多可达 12 根） 。
( 9 ) 将胶条排列在每个槽的中间，以 DryStrip 覆盖油覆盖。即使未使用，也要将所有槽内填入覆盖油。
( 10 ) 润湿电极滤纸片，吸去多余水分。
( 11 ) 将电极滤纸片置于胶条的两端，轻微接触胶条。
( 12 ) 将可移动电极固定于 24 cm IPGPhor Manifold 多功能盘中。将电极置于滤纸片与胶条接触部分。
( 13 ) 固定好电极位置，盖上 IPGPhor 电泳仪的盖子。
( 14 ) IEF 运行的条件必须根据不同的提取物凭经验决定。但以下参数适用于面粉 /Tris - CaCl2 法提取物：500 V 、1 h；1000 V、1 h；8000 V、8.20 h。总计 65500 Vh。
( 15 ) IEF 结束后，移出胶条，除去多余覆盖油，将胶条置于 10 ml 塑料吸管中 ( 去掉尖端使胶条能放入）。用封口膜密封，储存于 -80℃。
3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
3.3.1 使用仪器为 GE Healthcare Ettan Dalt II
( 1 ) 玻璃板用清洁剂浸泡过夜，去离子水冲洗，再用乙醇和 RO ( 反渗透）水冲洗，风干。
( 2 ) 根据使用说明书将凝胶板组装（见注 5 关于硅密封胶的使用，如果使用的是非自封的胶板，确保胶板四周完全密封）。
( 3 ) 制备多块胶时，在每块凝胶盒间用可重复使用的塑料垫片隔开，将凝胶盒装入制胶盒。保证凝胶盒紧密填充，且通过用硅脂涂抹橡胶密封垫使前板与灌胶盒形成完好密封。拧紧面板上的螺栓，水平放置灌胶盒。
( 4 ) 接上制胶管和漏斗，用夹钳和立架保持垂直。
( 5 ) 如使用取代液，漏斗准备就绪后加入 100 ml 替换液至平衡室。如果不使用替换液，在灌胶后可通过用大量 热水从管内冲走聚合的丙烯酰胺。
( 6 ) 12 块 10% 的凝胶使用 1 L 凝胶溶液：250 ml 1.5 mol/L Tris - HCl，pH 8.8；333 ml 30% ( V/V ) Duracryl 0.65% (m/V ) bis；407 ml 水。搅拌，置于 2 L 布氏烧瓶中除气 15 min。
( 7 ) 加入 10 ml 10% (m/V) SDS，稍加搅拌。
( 8 ) 用前加入 2.5 ml 10% APS 和 0.5 ml TEMED，搅拌。
( 9 ) 将丙烯酰胺溶液灌入漏斗，不断补足（重要的是不能使漏斗中溶液完全流空，否则会在胶内形成气泡）。持续加液直至胶面离第一块前板顶端 1~2 cm ( 约 1 L ) 。
( 10 ) 移去漏斗，使替换液向下流入灌胶模具（caster ) 底部的 V 形槽。
( 11 ) 在每块胶顶端覆盖 1 ml 水饱和正丁醇，放置 3~4 h 待凝胶聚合。
( 12 ) —旦聚合完成，拆除灌胶盒，移去凝胶盒，用去离子水漂洗凝胶盒以去除水饱和丁醇，以及少量附着在凝胶盒外面上的小块凝胶。
( 13 ) 配制 1 : 4 ( RO 水）稀释的 1.5 mol/L Tris-HCl ( pH 8.8 ) 作为凝胶存储液使用。
( 14 ) 将凝胶置入一个大的塑料盒，加入足够的凝胶存储液以完全覆盖凝胶。
( 15 ) 凝胶在 2~4℃ “成熟” 10~14 天之后可供使用，但从制胶之日起一个月以后不能再用。
3.3.2 凝胶电泳
( 1 ) 每根 IPG 胶条用 10 ml 冻存的预制平衡液，在 4℃ 冰箱或冷室解冻过夜。
( 2 ) 准备 7 L下槽液：25 mmol/L Trizma 碱，15 mmol/L 冰醋酸。
( 3 ) 将缓冲液倒入 Ettan Dalt ll 槽，打开泵冷却到 15℃。
( 4 ) 准备上槽液：3 L 200 mmol/L Tris 碱，0.4% (m/V) SDS，200 mmol/L Tricine。
( 5 ) 用水冲洗 IPG 胶条去除多余覆盖油，在含 1% (m/V) DTT 的 10 ml 平衡液中平衡 15 min。
( 6 ) 弃去平衡液，再加入 10 ml 含 4% (m/V) 碘乙酰胺的平衡液温育 15 min。由于碘乙酰胺感光，管子外要包上铝箔。
( 7 ) 将第二向胶从冷藏处取出，用上槽液清洗凝胶顶端 3 或 4 次。
( 8 ) 向凝胶盒槽内填灌上槽液，并加载胶条。按惯例，胶条的酸性端是在凝胶的左边。确保胶条和凝胶间没有气泡存在。
( 9 ) 润湿凝胶盒边缘，以顺利穿过橡胶密封管的通路，将凝胶放入电泳槽。如果不足 12 块胶，则使用 Perspex空白。
( 10 ) 加入上槽液，避免影响凝胶盒槽，盖上盖子，使用以下参数运行： 第 1 步：恒功率= 60 W ( 5 W/胶）；时间 0.15 h；温度 = 15℃；泵 = 自动。第 2 步：恒功率=120 W ( 10 W/胶）；时间 2 h；恒功率 = 240 W ( 20 W/胶）；时间 6 h；温度 = 15℃；泵 = 自动。
( 11 ) 当染料前沿离胶底端 0.5~1.0 cm 时停止电泳。总的运行时间约 8 h。
( 12 ) 撬开玻璃盒，每块凝胶切角以指示方向。将凝胶置入合适的染液（ 见后述 ）。
3.4 凝胶染色
为了用蛋白质组学研究 2D 胶上蛋白点，染色必须与质谱分析兼容，且灵敏度越高越 好。符合这些标准的染色法有好几种可供使用，包括胶体考染、某些银染和各种荧光染剂，如 Sypro Ruby、Orange、Deep Purple 和 Flamingo。胶体考染灵敏性不如银染和荧光染料，但是便于使用且相对便宜（见注 6 关于灵敏度部分）。银染是一种多步式的过程，但能使较低丰度蛋白显现。然而，由于没有终止点，高丰度蛋白 可能会过度着色。同时，银染的重复性可能不佳，因为染色程度取决于操作者。所有染色过程都需要在振荡器或摇床上进行，在染色/脱色过程中提供温和的振荡。
3.4.1 胶体考马斯亮蓝 G250
( 1 ) 在 50%（V/V）甲醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA ) 中过夜固定凝胶。
( 2 ) 在胶体考马斯染料中染色（按照使用说明书用甲醇稀释）（Bio- rad；4 : 1 染料：甲醇）。
( 3 ) 用 25%（V/V）甲醇，7%（V/V）乙酸脱色 1~5 min。
( 4 ) 用 25%（V/V）甲醇脱色过夜，保存在水中。
3.4.2 银染（参照 [ 13 ])
( 1 ) 凝胶用 40%（V/V）乙醇、10%（V/V）乙酸（或 TCA）固定 30 min。
( 2 ) 置于“敏化液” 中 30 min：30%（V/V）乙醇，0.2% (m/V) 硫代硫酸钠 ( sodium thiosulphate ) ，0.5 mol/L 乙酸钠。
( 3 ) 用蒸馏水洗三次，每次 5 min。
( 4 ) 加入银溶液 [ 0.25%（m/V）硝酸银]，染色 20 min。
( 5 ) 用蒸馏水洗两次，每次 1 min。
( 6 ) 置于“显影液” 中：0.24 mol/L 碳酸钠，每升溶液加 200 μl 37% 甲醛 ( 0.0074% 终浓度）。
( 7 ) 溶液变得混浊或 10 min 后加入新鲜显影剂。继续显影直到达到所要求的染色程度。
( 8 ) 加入 0.04 mol/L EDTA 10 min 终止反应。
( 9 ) 用蒸馏水洗两次。
( 10 ) 保存在水中。
3.4.3 Sypro Ruby 蛋白染色
( 1 ) 胶用 40%（V/V）甲醇，10%（V/V）TCA 固定过夜（18 h ) 。
( 2 ) 用 Sypro Ruby 染料在暗处染色过夜。Sypro Ruby 是光敏感的，所以凝胶需要在暗室中处理，凝胶储存盒要盖上铝箔。
( 3 ) 凝胶用 10%（V/V）甲醇、6%（V/V）TCA 脱色。
( 见注 7 关于 Sypro Ruby 的使用和废液处理）
3.5 凝胶成像与分析
有不同厂商的成像系统可供使用。扫描仪必须具有高分辨率，如需进行凝胶斑点质谱分析，扫描仪还要与切点仪（spot picker) 结合。
同样的，有许多软件包可供使用，允许凝胶匹配，产生合成（或参照）凝胶。 斑点体积、峰高和峰面积也可通过不同程序包获得，因而能对处理进行比较。有必要进行进一步的数据分析，如主成分分析（PCA ) ，所以胶分析程序包所得的数据必须能转换成 Excel 数据表，并与统计软件包兼容。
3.6 酶解前胶块脱色 （参照 [ 14 ])
3.6.1 对于考马斯和 Sypro Ruby 染色凝胶块
( 1 ) 在水中浸置 15 min，弃去水，继续在 50 : 50 的水：乙腈中再浸置 15 min。
( 2 ) 重复上述清洗步骤。
( 3 ) 倒去所有液体，用乙腈覆盖胶块 5 min，此时胶块应该不透明并脱水。
( 4 ) 弃乙腈，加入 0.1 mol/L NH4CO3，使胶块再水化，放置 5 min。
( 5 ) 加入乙腈使乙腈：NH4CO3 比例为1 : 1，孵育 15 min。
( 6 ) 弃液体，抽真空离心使之干燥。
3.6.2 对于银染胶块
( 1 ) 将胶块放入“ Farmer’ s 还原剂” [20% (m/V) 硫代硫酸钠、1% (m/V) 铁氰化钾与水 1 : 1 : 1 混合 ] 直到胶块完全干净。用水冲洗。
( 2 ) 弃液体，抽真空离心使之干燥。
3.7 还原和烷化（参照 [ 14 ])
( 1 ) 胶块在 10 mmol/L DTT、0.1 mol/L NH4HCO3 中，56°C 浸置 45 min 使之泡胀。倒去多余液体，迅速换以 55 mmol/L 碘乙酰胺、0.1 mol/L NH4HCO3，室温，暗处孵育 30 min。
( 2 ) 弃去碘乙酰胺溶液，用 1 : 1 乙腈：0.1 mol/L NH4HCO3 清洗胶块 15 min。
( 3 ) 弃液体，抽真空离心使之干燥。
3.8 酶解
胰蛋白酶胶内消化（参照 [ 14 ]) :
( 1 ) 加入足量的胰蛋白酶溶液，刚好覆盖胶块，冰浴 45 min 使之泡胀。
( 2 ) 弃去多余液体，加人 25 mmol/L NH4HCO3/5 mmol/L CaCl2，刚好覆盖胶块。
( 3 ) 37℃ 温育过夜。
( 4 ) 肽段分离：快速离心收集消化物到底部，加入最小体积 25 mmol/L NH4HCO3，室温孵育 15 min。
( 5 ) 加入等体积乙腈，混匀，室温下孵育 15 min。
( 6 ) 收集上清，再用 5%（V/V）甲酸：乙腈（1 : 1 ) 重复抽提两次。
( 7 ) 合并上清，抽真空离心使之干燥。
3.9 利用 Zip Tips 为质谱分析进行多肽除盐和浓缩
3.9.1 MALDI - MS
( 1 ) 10 μl 0.1% (V/V) TFA 重悬消化物。
( 2 ) 10 μl 50: 50 乙腈：水润湿吸管尖，重复两次。
( 3 ) 10 μl 0.1% ( V/V) TFA 平衡管尖，重复两次。
( 4 ) 上下吸抽 10 次将样品吸入管尖（将多肽吸附到 tip ) 。
( 5 ) 0.1% TFA 清洗管尖。
( 6 ) 用 4 μl 50:50 乙腈：水，0.1% TFA 洗脱。
3.9.2 ESI-MS ( 参照 [ 15 ])
( 1 ) 10 μl 含 1% (V/V) 甲酸的 4%(V/V) 甲醇重悬消化物。
( 2 ) 10 μl 1% 甲酸润湿吸管尖，重复两次。
( 3 ) 上下移液 10 次进行蛋白质消化。
( 4 ) 用 10 μl 0.1% (V/V)甲酸清洗管尖。
( 5 ) 用 4 μl 含 1% ( V/V ) 甲酸的 70% (V/V) 甲醇洗脱。
3.10 MALDI 靶板点样
( 1 ) 1 μl 消化物与 1 μl 基质混合。
( 2 ) 点样于 MALDI 靶板，室温下风干。 展开 |
|---|
