hESCs传代、冻存及复苏
实验概要
hESCs传代、冻存及复苏
主要试剂
KODMEM、0.25%Trypsin、1 mg/mL胶原酶Ⅳ或者Dispase、0.1%明胶、细胞基础培养液、hESCs培养液、冻存液C
主要设备
2 mL移液管、5 mL移液管、10 mL移液管、15 mL移液管、25 mL移液管、15 mL离心管、50 mL离心管、计数器、巴斯德管、倒置显微镜、培养箱、水浴锅、生物安全柜、体视镜
实验步骤
1）hESCs的传代
！注意：传代的前一天复苏饲养层细胞。
①观察细胞克隆大小及饲养层状况，当克隆完全展开并生长时进行传代，一般传代5～7天后，就可以进行另一次传代。
②传代前的半个小时，将将饲养层细胞中的培养液换成hESCs培养液。
③弃去原培养液，加入1 mL KODMEM到1个6孔培养板的孔清洗细胞。
④弃KODMEM，每个6孔培养板的孔加入1 mL浓度为1 mg/mL的胶原酶Ⅳ，放入CO2培养箱中孵育5 min。
！注意：消化hESCs时，消化时间和酶的活性有非常大的关系，新配制的酶溶液消化时间是5 min左右；如果所配酶溶液存放时间过长（超过两星期）可能导致消化时间较长，请根据镜下细胞状态适当延长时间。
⑤观察克隆的边缘是否与饲养层分开并发亮、稍微卷起
⑥弃掉上清，加入2 mL hESCs培养液，用1 mL的移液枪柔和吹打细胞15 s左右，然后镜下观察，待克隆已成大小相对均一的块状，1000 r/min室温离心2 min，收集细胞。
！注意: 吹打细胞时可以选择1 mL枪头也可以用玻璃巴斯德管，不管用巴斯德管还是用枪头，都需要对巴斯德管头或枪头进行处理，最好是光滑圆润状，以不伤害干细胞为好。
⑦弃掉上清，用hESCs培养液重悬，在起初密度较满的情况下，1：6进行接种。
2．hESCs的冻存
①～⑤同hESCs的传代步骤①～⑤。
⑥弃掉上清，用冻存液悬浮细胞。每个冻存管内加入0.5 mL细胞悬液。然后用程序冻存盒或分步法冻存。
！注意: 由于hESCs较难复苏，很多公司推出了成品的hESCs冻存液，可以选择成品的冻存液，也可以实验过程中现用现配。配制好的冻存液可放于4℃冰箱暂时保存半天左右。
3．hESCs复苏
①准备15 mL离心管，加入hESCs培养液9.5 mL。
②液氮中取出冻存管，迅速放入37℃水浴锅融解细胞悬液。
③75%酒精擦拭冻存管，柔和吸出冻存液，缓慢加入已准备好的离心管中，室温1000 r/min离心2 min。
④弃上清，加入hESCs培养液悬浮，按照冻存管上标记的密度进行接种。
！注意：复苏过程中勿剧烈吹打。
