凯氏定氮法与纳什比色法测定植物组织中总氮含量的比较
氮是植物生长发育的重要营养元素之一，植物叶片中氮素含量高低常可作为施氮效应及氮素需要的诊断指标。因此，氮素含量的测定在教学中是一个重要的教学内容，在科研研究中是常测定的一个指标。植物组织全氮测定常用方法是凯氏定氮法，即利用浓H2SO4-H2O2消煮，将样品中有机物和有机含氮化合物转化为无机铵盐，再用蒸馏滴定的方法测定全氮含量。有文献报道，植物样品中氮的含量也可采用纳什比色法测定，即获得消化液后，采用纳什比色方法测定消煮液中铵离子的浓度，然后通过计算获得样品中氮的含量。
甘蔗是需氮量较大的作物，氮肥不足会影响甘蔗的生长，氮营养过剩则会增加生产成本，造成肥料浪费和环境污染。本试验利用H2SO4-H2O2法消化获得消煮液，用蒸馏滴定法和纳什比色法测定甘蔗叶片样品中的全氮含量，分析比较2种方法的测定结果及其优缺点，为植物样品的快速测定提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1材料来源
取生长盛期健康的甘蔗+3叶片，在105℃烘箱内杀青30min，在60℃～70℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎密封保存备用。
1.2待测液的获得
准确称取0.2g（精确至0.0001g）粉碎样品置于消化管中，3次重复，加入5mL浓H2SO4，瓶口加一个小漏斗，摇匀，过夜，另取一个消化管，不加样品，只加同样的浓硫酸作为对照。将消化管置于控温式远红外消煮炉上消煮，中间视消化情况加1mLH2O21～2次加速氧化，直至消煮液呈无色或清亮色。待消化管冷却，用少量水冲洗小漏斗，将消化液无损失转入100mL容量瓶并定容，澄清上清液即为待测液。
1.3滴定法测定全氮
对蒸馏装置进行洗涤，并确保干净后，准确吸取定容后的消煮液10.0mL于反应器中开始蒸馏，将馏出液出口的冷凝管下端管口插入盛有30ml的硼酸吸收液和5～6滴混合指示剂的三角瓶中，当三角瓶中溶液开始变绿时开始记时，四分钟后将三角瓶移离冷凝管口，继续蒸馏1分钟后将三角瓶移离蒸馏装置，用水冲洗冷凝管及馏出液管，然后用0.01mol/LHCL标准酸滴定，溶液由绿色变为淡紫色为滴定终点并记录所用酸体积，同时作一空白试验。依据公式计算全氮含量：
N（%）=（V1-V0）×C×14×Ts×10-3×100/m
其中：N：植株的全氮含量；V1：样品测定值消耗标准酸的体积数（mL）；V0：空白试验所消耗标准酸的体积数（mL）；C：标准酸的浓度（mol/L）；14：氮原子的原子质量（g/mol）；Ts：分取倍数；m：干样品质量（g）。
1.4纳什比色测定
标准曲线的制作：分别吸取10μg/mLN（NH4-N）标准液0、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50mL于6个50mL容量瓶中，每个加入100g/L酒石酸钠溶液2mL，充分摇匀，加入纳什试剂2.5mL，用水定容后充分摇匀。30min后用分光光度计在波长420nm测定。用所得数据制作标准曲线，根据标准曲线计算NH4+浓度。
吸取待测液2mL于50mL容量瓶中，按照标准曲线的方法测定样品中中的NH4+OD值，同时在样品测定的同时做空白试验，根据标准曲线计算比色液中NH4+-N浓度，再根据下面公式计算含氮量。
N（%）=p×V×Ts×10-4/m
其中：p：从标准曲线查的显色液N（NH4+-N）的质量浓度（μg/mL）；V：显色液体积（mL）；Ts-分取倍数：m：干样品质量（g）。
2.结果与分析
2.1比色方法的线性关系
根据所测定的OD值，制作标准曲线如图1所示，标准曲线的函数关系式为Y=0.2228x-0.0297，相关系数R2=0.9995，线性关系较高，可以满足试验的下一步计算。
2.2两种测定方法的结果比较
试验中所采用的两种测定方法结果的偏差除了第16号外，其他几个样品的结果偏差都小于2%，滴定法与纳氏比色法比值大于1的样品有1、8、10、13号（表1）。滴定法测定结果的标准差和标准误都小于纳氏比色法测定结果，同时滴定法的变异系数也比纳氏比色法的要小，但二者都小于2%（表2），两种测定结果都是可靠的。对两种测定方法的t检验结果从表3可知，95%置信区间的上下限分别为0.017和0.174，t值为2.582大于0.021，说明两组测定结果之间差异不显著，即用凯氏滴定法和纳氏比色测定法两种方法测定甘蔗样品的全氮含量差异不显著，表明用两种方法的任何一种测定甘蔗叶片全氮，均不影响其试验结果。
3 讨论与结论
凯氏定氮法是测定植物组织全氮的国家标准方法。该方法虽不需复杂的仪器设备，但滴定终点易受人为因素的影响，且蒸馏耗时太多，对快速批量测试来说费时费力。纳什比色法采用比色的方法，根据分光光度计比色槽的设定可同时测定5～7个样品，避免人工蒸馏和滴定的繁琐过程，大大提高了工作效率。
本试验测定结果表明，凯氏定氮法和纳什比色法二者测定结果关系不显著，其中凯氏滴定法变异系数小，蒸馏结果准确可靠，优于纳什比色法，但纳什比色法设备简单，效率较高，且与滴定法没有达到显著差异，如果样品量较大，又仅仅是比较不同处理间的氮含量差异，纳什比色法是一种快速效率较高的测定方法，减少了凯氏定氮法中的蒸馏与滴定操作，节省时间与资源，更为方便。在实验过程中，可根据自己试验的目的要求，选择合适的测定方法。
值得注意的是要使测定结果有更好的准确度，在测定过程中要认真掌握各个细节及相应的注意事项。如在滴定法测定时要注意加入NaOH量得控制，过多反应剧烈，造成NH4+-N损失，过少蒸馏又不完全。[5，6]在应用纳什比色法测定时要注意显色溶液的pH值应≥11，NH4+-N的浓度控制在0.2～3.0mg/L；稳定时间要有保证，当温度低时应稳定1h再进行比色测定。[7]只有注意到这几个测定细节，才能保证测定结果的准确性。
因此，凯氏滴定法和纳什比色法都可以用来测定甘蔗组织中的全氮含量，二者的测定结果差异不显著。在方法选择上，可根据自己的试验条件和试验目的要求，选择合适的测定方法，但在使用两种方法的同时，应该细致掌握各方法的注意事项。
