ImageXpress Micro高内涵3D细胞球成像检测手册（二）
3.2 2D 分析方法
3.2.1. 2D 分析方法的实现
细胞球作为一个三维结构，可通过其二维投影或二维结果来间接反映三维结构的特性。对于宽场荧光成像和明场成像，由于其 Z 轴分辨能力较弱，通常难以直接进行三维重构和分析，而主要进行二维方法进行分析。当然，目前有多种 3D 反卷积算法，如AutoQuant、Huygens 等提供的 3D 反卷积盲算法能够大大提高宽场荧光的 Z 轴分辨率，其结果可以以三维的方法进行分析，参考后文。
要获得二维投影图像，需要对细胞球进行 Z 序列成像后，来获得二维的最终投影图像。
如上图，先对细胞球的各个层面位置进行 Z 序列成像后，对获得的Z序列图像进行景深扩展或 Best Focus 处理后，能够得到3D 细胞球的高质量 2D 投影图像。其中 Z 序列图像通常不采用最大投影 (Maximal Projection) 的方法，因为该方法会造成背景信号的累积，降低最终 2D 投影图像的信噪比，并最终影响到分析结果。获得的 2D 投影图像，采用常规的 2D 分析方法，即可实现对于 3D 细胞球的定量分析。
对于共聚焦成像系统，由于系统本身就提供很高的 Z 轴分辨率，可通过对 Z 序列图像的每一层图像进行 2D 分析，对获得的每一个 2D 结果平均化 / 或求和后，来反映 3D 结构的信息。
3.2.2. 2D 分析方法的缺陷
2D 是 3D 的投影或者子集。因此当通过共聚焦或 3D 反卷积获得了 3D 细胞的 Z 序列图像，获得了细胞球的 3D 内部信息后，通过 2D 的方法进行分析获得的结果只能从一个角度了解一个 3D 结构的信息，而无法获得全貌。因为 2D 只是 3D 的一个子集，所以 2D 的结果会由于方法的不同，会产生较大偏差 ( 如下图 )：
(1) 采用 2D 投影法会造成结果明显偏低
右侧为 3D 细胞球 Z 轴扫描其中的两个层面。其中层面 3 和层面 5 在图像相同的位置上 ( 红圈 ) 均有细胞，即在同一个位置上的上面和下面均有细胞，这些细胞在获得景深扩展图像中就类似于同一个细胞，造成 2D 投影法分析获得的细胞计数结果明显偏低。
(2) 采用分层求和法会造成结果明显偏高
右侧为 3D 细胞球 Z 轴扫描其中的两个层面。其中层面 8 和层面 9 均拍摄到了同一个的不同层面，造成分层求和法分析获得的细胞计数结果明显偏高。
(3) 当需要检测不同细胞的距离和位置等空间信息时，两种方法也会造成明显的问题，如分层求和法无法进行位置和距离信息的测定； 2D 投影法由于获得的只是一个平面的投影，其结果会明显偏低或错误 ( 如细胞上下层叠时 )
3.3 3D 分析方法
当然，要想全面准确地获得 3D 细胞球的信息只能通过 3D 分析方法。3D 分析方法能够自动对 3D 细胞球进行三维空间重构，并在重构的三维空间进行细胞的定量测量 ( 细胞数量，大小，体积，表面积等 ) 和位置信息测量 ( 空间距离、位置等 )。
目前有一门新兴的细胞应力学，通过对三维肿瘤细胞球、肿瘤组织中细胞的“拥堵特征”和“相变”( 通过三维结构内细胞之间接触面积和空间细胞形态 ) 对肿瘤进行研究，并对肿瘤细胞的转移基质研究取得相当进展。
四、ImageXpress Micro 家族产品进行 3D 细胞球培养和检测的优势
1 可用于所有 3D 细胞球方法
ImageXpress Micro 家族高内涵产品具有极强的兼容性和扩展性，能够用于目前所有的 3D 细胞球的成像，并且同时支持新近出现的 3D 成像新方法，如 3D 细胞微流控、3D 微器官等实验的快速成像和分析。优化完善超过 15 年的激光自动聚焦系统能够快速找到 3D 细胞球的焦平面位置进行清晰成像。激光自动聚焦同时结合图像自动聚焦技术，可以在不同孔内 3D 细胞球大小不同和悬浮高度不同的情况下也能准确快速找到 3D 细胞球的精确焦平面位置，实现快速准确的细胞球成像。
2 完善的激光自动聚焦 + 图像自动聚焦，支持各种 3D 细胞球制作方法和未来新耗材的升级空间
IXM 系列高内涵系统完善且独特的激光自动聚焦系统，能够跟踪样品内的任意平面，达到快速精确的聚焦目的，能够在 0.3 s内快速根据 3D 细胞球板材的设定准确定位细胞球。
以上为 Hanging drop plate 获得的 3D 细胞球进行快速激光自动聚焦的示意，IXM 能够自动获得多个界面的反射光，并确定细胞球的位置。因为细胞球稳定悬浮于液面上面 ( 表面张力作用 )，通过确认细胞球的大概直径，系统可通过细胞球液面界面为基准，快速准确地获得细胞球 Z 轴精确位置。若通过图像自动聚焦进行设定，系统找到细胞球 Z 轴精确位置后，能够精确定位细胞球的任意层面。
3 高效灵活的 Z 序列采集，节省时间和空间
ImageXpress Micro 家族产品整合有高效方便的 3D 成像功能，能够非常方便地进行细胞球的 3D 成像和 2D 成像。系统提供了自动化的 Best Focus 景深扩展功能，一次设置即可获得，无需后续操作。灵活的功能允许单独采集 3D Stack 图像或 2D 景深扩展图像，或者同时采集，方便客户平衡 3D 的准确成像和 2D 景深扩展的需求。
4 转盘共聚焦 + 3D 反卷积
ImageXpress Micro Confocal (IXM-C) 是一款高度灵活且具有高成像质量的共聚焦高内涵系统。其具有的多种共聚焦转盘能够实现高通量和高分辨率的成像。宽场或共聚焦成像的基础上进行反卷积处理获得更高分辨率和信噪比的图像是生物学成像的常用方法。IXM-C 在转盘共聚焦的基础上同时具有 3D 反卷积功能，其获得的转盘共聚焦图像本身具有极好的 Z 轴分辨率。通过结合 3D 反卷积功能，能够进一步提高 XYZ 方向上的分辨率，能够获得更加清晰的图像细节 ( 如上图 )。
5 强大的 3D 分析功能
如前所述，3D 细胞球的图像通过不同的 2D 识别分析可获得一定的数据，但采用 2D 分析方法的缺陷十分明显 ( 见前文 )。3D细胞球实验准确的数据结果依赖于 3D 分析工具来实现。ImageXpress Micro 高内涵系统具有高性能的 3D 分析工具。可以实现软件自动在三维层面识别细胞，并自动进行三维结构重构，并在重构的三维结构中进行细胞的识别和分析。
6 并行分析计算
ImageXpress PowerCore 是用于 MD 高内涵系统的并行分析计算功能，能够实现以下有用功能：
A：图像采集过程中同步进行图像分析 ( 不会影响图像采集速度 )。
B：大大加速图像分析所用时间。
当进行 3D 成像和分析时，由于需要进行不同层面的多个 Z 轴图像来进行 3D 信息的准确获取，获得的图像数量和分析负荷会明显增大。采用 ImageXpress PowerCore 能够明显提升图像分析的速度，大幅度提升通量，并能够提供比图像采集速度更快的分析速度。以下例子能够直观地反映出 ImageXpress PowerCore 的强大功能。
7 3D 细胞球 + 细胞功能检测
常规体细胞的细胞系或者肿瘤细胞系是做 3D 细胞球实验的常规对象细胞。对于某些特殊细胞，如神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、内分泌细胞，其正常生理特性依赖于其特定的细胞特性，如动作电位、局部电位变化、离子释放等。MD 高内涵系统不但能够进行 3D 等复杂实验的成像分析，包括以上特殊细胞类型的诸如动作电位变化频率、速度等能够进行快速成像和特性分析。
iCell 分化获得的神经细胞，在小型凝胶培养基内生长成为神经网络。通过钙离子试剂的标记，可以看到神经细胞上由于动作电位引起的钙离子释放，说明神经网络功能良好。软件系统能够自动识别荧光标记的细胞，并自动分析电信号 ( 钙离子释放 ) 的变化频率和幅度。
五、总结
3D 细胞球检测技术会带来较传统 2D 细胞检测方法更加准确可靠，且更加接近于临床实验的结果。准确的结果在药物筛选上能够大大降低药物筛选的成本和时间，而在科研上，由于其先天的优势，能够更加真实地反映出细胞的生物学表现和反应。3D 细胞球技术是一种基础方法，随着技术的发展，出现了更多特异化的方法，如类器官，微组织等方法，为生物学研究和药物筛选提供了更加有力的武器。
3D 细胞球技术，由于其本质为三维结构，因此，只有通过三维成像和分析技术才能获得准确可靠的结果。Molecular Devices 公司的 ImageXpress Micro 系列高内涵系统，不但提供了 3D 细胞球技术实现的所有细节和功能，包括3D 成像及 3D 分析，其对于目前市场上 3D 细胞球技术的耗材实现了全兼容。其完善的激光自动聚焦+图像自动聚焦技术有极大的容忍性和开放性，能够实现未来新型耗材和方法的检测和分析。MetaXpress PowerCore 高内涵并行加速软件系统能够大大提高系统分析通量，加速药物检测和时间和人力成本。
