电泳技术原理、分类及分析方法（六）
五、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(R''<[m]>)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
1.仪器装置
除另有规定外，同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.试剂
(1)丙烯酰胺液溶
称取丙烯酰胺 22.2g与双丙烯酰胺0.6g， 溶于100ml水中，贮于褐色瓶中低温保存。
(2) 凝胶缓冲液
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、 磷酸氢二 钠(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g与十二烷基硫酸钠2.0g，加水至1000ml(若有沉淀析出,可加温至 37℃溶解)。
(3)电泳缓冲液
将凝胶缓冲液稀释 1倍。
(4)染色液
称取 25mg考马斯亮蓝R<[250]>,溶于57％乙醇与9.2％醋酸混合液100ml中。
(5)脱色液
取无水乙醇 75ml，加冰醋酸50ml，用水稀释至1000ml。
3.操作法
除下列规定外，其他均同聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(1)制胶
用丙烯酰胺溶液－凝胶缓冲液－水－1.6％过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺(需冷却)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配制而成。
(2)标准蛋白溶液及供试品溶液的制备
取标准蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，与水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠 0.04g，溶于40ml水中)1∶3混合，置冰箱中过夜。供试品照上述方法配制。
(3)电泳 调节电流使每管为 8mA。
4.相对迁移率和分子量计算
将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。按下式计算相对迁移率： 蛋白移动的距离
染色前的胶条长度 相对迁移率(R''<[m]>)＝───×─── 脱色后的胶条长度 染料移动的前沿距离 以
R''<[m]>为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上绘图,由标准曲线中查出供试品分子量。
