噬菌体转导实验原理、材料和实验步骤（二）
四、实验步骤
1、噬菌体的诱导和裂解液的制备
（ 1 ） 供菌体的活化与培养：取一环供体菌，接种于盛有 5 ml 肉汤液体培养基的三角瓶中， 37 ℃培养 16 h 后，吸 0.5 ml 菌液，接种于盛有 4.5 ml 肉汤液体培养基的三角瓶中，继续培养 4-6 h 。
（ 2 ） 制备悬浮液：将三角瓶中的菌液倒入离心管，以 3500 rpm ，离心 10 min 。离心后，除去上清液，加 4 ml 磷酸缓冲液，打匀沉淀，再以 3500 rpm ，离心 10 min ，这样反复洗三次，制备成悬浮液。
（ 3 ） 诱导裂解：取悬浮液 3 ml 于培养皿中，经 UV 处理（ 15W ，距离 40 cm ），诱导 10-20 s 。
（ 4 ） 避光培养： UV 处理后，加入 3 ml 2E 肉汤液体培养基，为防止光复活， 37 ℃避光培养 2-3 h 。
（ 5 ） 制备裂解液：吸取培养物于离心管中，以 3500 rpm ，离心 10 min ，吸取上清液，再加入 0.2 ml 氯仿（ 4-5
滴），激烈振荡半分钟，静置 5 min ，小心把上清液用无菌吸管转移到另一试管，这就是噬菌体 ( λ )gal + 的裂解液。
2 、 噬菌体效价测定
（ 1 ） 受菌体的活化与培养：挑取受体菌一环，接种于盛有 5 ml 肉汤液体培养基的离心管中， 37 ℃培养 16 h
。然后，从受体菌培养液中吸取 0.5 ml ，放入盛有 4.5 ml 肉汤液体培养基的三角瓶中，继续培养 4-6 h
，作指示菌用；剩余的菌液用于点滴法转导试验，随即放入冰箱保存，供后面涂布转导试验用。
（ 2 ） 双层培养测效价：①取已经熔化并于 45 ℃保温的半固体琼脂试管 4 支，每支加上述的指示菌液 0.5 ml 。②取噬菌体裂解液
0.5 ml ，放入盛有 4.5 ml 肉汤液体培养基的试管中，依次稀释到 10-7 。③从 10-6 、 10-7 的试管中分别吸取 0.5
ml 裂解液，加到有指示菌的半固体琼脂中（每个稀释度 2 支），摇匀，分别倒入事先准备好的肉汤固体培养基培养皿中，摇匀，凝固后， 37
℃培养过夜，观察出现噬菌斑数，并计算噬菌体裂解液的效价。
计算方法：效价（单位 / 毫升） = 两皿平均斑数 * 稀释倍数 * 取样量折算数。
图 4-3-2 培养皿皿底画线
3、 转导方法
（ 1 ） 点滴法：①取倒好 EMB 培养基的培养皿 2 只，在皿底用记号笔按图 4-3-2
中的样子画好。②取一满环受体菌，涂出一条菌带，共涂二条， 37 ℃培养 1.5 h
。③取出培养皿，在二个圆圈和四个方格处，各加一环噬菌体裂解液，二个圆圈作为对照，四个方格作为转导处理，培养 2 天，观察结果。
（ 2 ） 涂布法：①取倒好的 EMB 培养皿六只，先做好标记，其中两只加 0.1 ml 噬菌体裂解液，用于对照；两只加 0.1 ml
受体菌，也用于对照，两只加噬菌体裂解液和受体菌液各 0.05 ml 。②用玻璃涂棒将各皿上的菌液（或噬菌体裂解液）涂开，相同的 2
只培养皿用同一根玻璃涂棒， 37 ℃培养 2 天，观察结果。
五、实验结果
观察记录下表数据，并分析实验结果。
表 1 噬菌体效价测定
|
噬菌体来源 |
裂解液稀释度 |
取 样 |
噬菌斑数 /皿 |
噬菌体数 /皿 |
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噬 菌 体（λ）裂解 液 |
10 -6 |
0.5 ml |
||
|
10 -7 |
0.5 ml |
表 2 细菌转导结果
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转 导 试 验 |
点 滴 法 |
涂 布 法 |
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受 体 菌 |
噬菌体裂解液 |
受体菌 + 噬菌体裂解液 |
受体菌 |
噬菌体裂解液 |
受体菌 + 噬菌体裂解液 |
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| 菌落生长情况 | ||||||
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菌落 色泽 |
注：菌落生长者：“ + ”表示；菌落不生长者：“ - ”表示
