m6A RNA甲基化在发表多篇10+文章的运用

　　最近小编检索了关于m6A修饰的文章发表情况，发现目前2020年发表的关于m6A修饰的文章已经达到309篇，已经追平2019年整年度发表篇数，可以预见m6A RNA修饰下半年年发表文章会呈现出爆炸式增长。

　　图1. 近6年m6A RNA修饰相关文章发表情况（ data from PubMed）

　　那么您是否已经了解m6A修饰10+ 高分文章的研究思路呢？刚好小编读到一篇关于m6A修饰的文章，可谓也是我们推荐的m6A修饰常见的研究模式（RNA修饰与关键酶），思路之清晰、手段之全面、机制之详尽，其他生物学过程/领域完全或部分都可以套用这篇文章的思路，10 +文章妥妥的！！强烈建议收藏！！让我们来重温如何玩转m6A修饰10+文章！

　　Molecular Cancer （IF=10.679）杂志刊登了m6A修饰最新研究：m6A依赖的糖酵解增强结直肠癌（CRC）发生发展。该文章采用多组学联合应用技术检测了Mettl3-KO(m6A甲基化转移酶敲除细胞株)和WT HCT116（结直肠癌细胞株）甲基化修饰，这项研究揭示METTL3通过m6A-IGF2BP2/3-依赖性机制稳定HK2和SLC2A1 (GLUT1)在CRC中表达，表明m6A修饰的糖酵解途径可以促进结直肠癌的发展，同时为以METTL3及其途径为靶点高糖代谢的CRC患者提供了合理的治疗靶点和治疗方向。

　　发表期刊：Molecular Cancer

　　影响因子：10.679

　　发表时间： 2020.4.3

　　实验方法: m6A-seq, RNA-seq，MeRIP-qPCR, RIP等（云序可提供以上服务）

　　文章链接： m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression

　　文章内容

　　（1）寻找RNA修饰关键酶METTL3

　　为了探寻m6A修饰与结直肠癌（CRC）的糖酵解代谢的相关性，采用qPCR检测结直肠癌患者体内脱氧葡萄糖吸收（FDG uptake）和m6A修饰相关酶表达的情况，发现Mettl3（m6A甲基化转移酶）的表达与FDG摄取存在明显的相关性。

　　图2. 结直肠癌患者体内Mettl3表达与FDG吸收相关

　　同时检测到在CRC体内Mettl3高表达和葡萄糖代谢强烈保持一致，那么在结直肠癌患者体内FDG和Mettl3的变化是否影响甲基化整体水平的变化呢？作者采用多种方法检测高FDG CRC和低FDG CRC患者体内甲基化水平，结果表明m6A修饰水平在这些FDG摄取较高的CRC患者中也显著升高。

　　图3. 甲基化化水平与FDG的关系

　　为了进一步说明Mettl3在CRC糖酵解过程中促进肿瘤发展的作用，作者通过RNA-seq(云序可提供此服务)分析比较Mettl3 KO和野生型的细胞（WT HCT116 CRC）基因表达情况。通过GO和KEGG分析，WT HCT116主要富集与葡萄糖代谢相关的信号通路，而Mettl3 KO细胞基因富集与糖酵解，葡萄糖反应物运输，糖异生等途径呈负相关。而进一步质谱代谢组学分析表明敲除Mettl3明显减少糖酵解途径关键成分的水平，如葡萄糖-6-磷酸，果糖 -1,6-二磷酸，丙酮酸和乳酸等。

　　图4. Mettl3参与CRC糖酵解过程

　　通过上面数据的分析，表明Mettl3可能介导CRC患者糖酵解代谢和癌变，因此可以确定以Mettl3作为CRC 糖酵解研究的关键RNA修饰酶。

　　（2）干预酶METTL3观察功能

　　为了进一步验证酶Mettl3的功能，通过敲除Mettl3后，乳酸（糖酵解的关键代谢物）的产生和葡萄糖的摄取均明显下降。为了弄清Mettl3的改变是否会直接影响糖酵解代谢，同时测量了CRC细胞的胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)，结果显示敲除Mettl3可显著降低HCT116和sw480细胞的ECAR水平，却不影响OCR水平。为了阐明Mettl3诱导的CRC糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，我们构建了Mettl3野生型(pcDNA3.1-Mettl3)和突变型(pcDNA3.1-Mettl3-mut，带有MTase结构域缺失)重组质粒。过表达Mettl3显著增加了乳酸的产生，葡萄糖吸收和ECAR水平。而且在CRC中，Mettl3的MTase结构域的缺失阻断了Mettl3诱导的糖酵解过程, 这些数据表明Mettl3通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。

　　图5. Mettl3驱动CRC中的糖酵解代谢

　　（3）干预酶METTL3观察细胞表型

　　进一步探索Mettl3对CRC细胞表型的影响，通过敲除酶Mettl3，一些关键的致癌基因表达受到抑制，如CDK1、PCNA、和CDCA7；观察到Mettl3敲除消除了细胞增殖、群落形成和肿瘤的生长；过表达Mettl3却促进了细胞增殖、群落形成和肿瘤的生长；并且使用2-DG(一种糖酵解途径的抑制剂)处理明显阻断Mettl3诱导细胞增殖和群落形成。这些结果表明Mettl3可能是一种肿瘤驱动基因，通过调控结直肠癌糖代谢促进CRC进展。

　　图6. Mettl3诱导的细胞存活依赖于糖酵解代谢

　　（4）m6A-seq & RNA-seq联合寻找酶靶点

　　通过关键酶的寻找和干预酶的功能，确定RNA修饰酶与肿瘤的联系，那么怎样寻找酶的作用靶点才是整篇文章的核心工作。作者这里利用m6A-seq和RNA-seq联合分析（云序可提供此服务）检测Mettl3敲除和WT HCT116细胞RNA修饰和RNA表达情况。Motif分析GGACG与经典的m6A修饰基序“GGAC”相似，而且80% Mettl3结合甲基化位点位于CDS区。与WT HCT116细胞相比，敲除Mettl3后有2363甲基化位点明显下调，584甲基化位点明显上调。利用甲基化和转录组表达联合分析，找到甲基化水平下降，同时mRNA表达水平也下降，与糖酵解密切相关的靶分子-HK2和SLC2A1(GLUT1)。

　　图7. m6A-seq和RNA-seq联合分析

　　进一步通过靶分子HK2和SLC2A1进行表达水平（qPCR）、甲基化水平(MeRIP-qPCR)的验证（云序可提供此服务)，充分证实靶分子作为Mettl3直接调控CRC糖代谢的靶点。

　　图8 . 靶分子表达和甲基化水平验证

　　（5）酶METTL3作用分子机制

　　研究已表明Mettl3是一种甲基化转移酶，可以调控靶分子的甲基化水平，那么是如何调节糖代谢过程呢？现有实验已表明Mettl3敲除或过表达不仅影响HK2和SLC2A1的甲基化水平，还调节HK2和SLC2A1的表达水平，这暗示着靶分子甲基化水平影响其表达，而双荧光素酶实验恰好证实了这一点。已有机制表明甲基化可以促进RNA分子的稳定，那HK2和SLC2A1甲基化是否也影响其稳定性呢？作者通过稳定性分析，发现敲除Mettl3降低了HK2和SLC2A1 mRNA的半衰期，也就是说甲基化促进了HK2和SLC2A1 mRNA分子的稳定从而影响其表达。作者进一步通过RIP-qPCR（云序可提供此服务）证实了 IGF2BP2（m6A识别蛋白促进mRNA稳定）与HK2结合，IGF2BP2/3与SLC2A1结合。这些数据揭示了Mettl3介导的m6A修饰通过IGF2BP2依赖和IGF2BP2/3依赖的mRNA稳定性调节，分别增加了HK2和SLC2A1 (GLUT1)的表达。

　　图8 . 靶分子与识别蛋白的结合

　　（6）靶分子HK2和SLC2A1功能验证

　　HK2己糖激酶和SLC2A1（GLUT1）葡萄糖转运体1都是糖酵解途径重要的调节基因，通过回补实验研究HK2和SLC2A1 (GLUT1)是否参与Mettl3在CRC中的生物学功能，HK2或SLC2A1 (GLUT1)过表达恢复了HCT116 Mettl3敲除细胞中乳酸的减少和葡萄糖摄取下降，显然HK2和SLC2A1 (GLUT1)介导了Mettl3在CRC细胞中的调控功能。

　　图9. 靶分子HK2和SLC2A1功能验证

　　总结：

　　综上所述，本文作者通过m6A-seq，RNA-seq，MeRIP-PCR，RIP-PCR等多种技术手段首次发现了m6A修饰与结直肠癌患者糖酵解途径激活密切相关。其机制是HK2和GLUT1受m6A修饰调控并参与结直肠癌的糖酵解激活，而Mettl3介导HK2和GLUT1的m6A修饰依赖于IGF2BPs对调控CRC的发病机制至关重要，所以靶向Mettl3及其通路可能有望用于治疗高糖代谢的结直肠癌患者。

　　图10. m6A修饰依赖于糖酵解参与结直肠癌发展机制

　　相信大家也对m6A功能机制探讨的思路有了更清晰的认知，那么研究过程中这些技术手段的使用是否会成为一种门槛呢？我们要说不，因为今天云序生物给大家带来了新的福利产品，提供RNA修饰研究一站式服务，让老师不再为技术问题而困扰，快速高效帮助老师将RNA修饰与自己的课题研究结合起来，深入挖掘RNA修饰功能机制探讨，我们来看看云序生物此次带来m6A研究重磅产品。

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