聚合酶链式反应(PCR)引物设计的基本原则
引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
引物内部不应出现互补序列。
两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。
引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
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