mRNA差异显示技术的原理

　　差异基因表达是细胞分化的基础。正是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期的调节、细胞衰老和死亡等。mRNA DD-PCR技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。不同的组织/细胞或遗传背景相同的同一组织/细胞经过不同的处理后，提取各自的总RNA，进行mRNA的逆转录合成 cDNA。进行逆转录时3'端引物采用oligo(dT)l2MN，其中M为A、C、G中的任何一种，N为A、C、G或T中的任何一种，所以共有12种oligo(dT)l2MN引物。其申M称为锚定引物，起增大引物Tm值的作用。N称为分类碱基，对逆转录进行归类。

　　用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的逆转录反应，从而使逆转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类(较为流行的是进行4种归类，即3'端引物采用oligo(dT)12M, M为A、C、G中的任何一种)。5'端引物采用20条由10个碱基组成的随机引物。对每一类cDNA进行随机引物和逆转录引物PCR扩增，通过对不同的组织/细胞或经不同处理的同一组织 /细胞的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物的凝胶电泳分析，从而反映出不同样品的基因在时间和空间上的组织特异性表达。简述其基本原理，就是将基因背景相同的2个或几个细胞系或组织mRNA逆转录成cDNA，用不同引物对，进行PCR扩增，扩增时加入同位素标记的核苷酸。用测序胶电泳分离PCR产物，经放射自显影即可找到被扩增的差异表达的基因。