原位合成芯片的制备方法介绍

方法一

Affymetrix公司将光平版印刷技术(photolithographicapproach)运用到DNA合成化学中，利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样性的化合物集合。该法利用光敏保护基来保护碱基单位的5’羟基。第一步利用光照射使固体表面上的羟基脱保护，然后固体表面与光敏保护基保护、亚磷酰胺活化的碱基单体接触，合成只在那些脱保护基的地方进行。光照区域就是要合成的区域，该过程通过一系列掩膜来控制。如此循环以合成寡核苷酸，直到设定的寡核苷酸长度。每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因存在于DNA芯片的特定位置上，可合成任意序列15—25个碱基长度的片段。这种方法可使每cm2上的探针数量达到106个，每种探针为5～10btm的方形区域，探针的间距约为20btm。这种方法的最大的优点就是可以在较小的区域内制造大量不同的探针，如1cm2可以有400 000种探针。后来由于运用了非线性半导体光抗技术(non—linear semicondutor photoresist technology)，而使探针的间距更加微小。Affymetrix公司已有可以同时检测人类全基因组的表达谱基因芯片及检测高达50万个SNP的基因芯片。

方法二

通过机械手臂直接将碱基合成试剂氨基膦酸酯点样到芯片适当的位置上，循环下去就能合成预计的寡核苷酸。由于这种方法灵活性高，能合成任意寡核苷酸片段，因此有应用潜力。美国Agilent公司便是利用喷墨的原位合成技术合成了60个碱基的寡核苷酸芯片产品。

方法三

用物理方法如掩蔽体来限定前体物质的位置，将前体物通过正交管道只需几步就能合成选定长度的所有相关序列的阵列。还有一种方法，用微型电极矩阵来对特定位置上延伸的寡核苷酸链进行去保护，矩阵与碱基合成试剂的反应使已去保护的寡核苷酸处添加一个碱基，从而得以延伸。这类方法不能在任意位置合成不相关的寡核苷酸，因此只能用于分析DNA多态性等基因型分析，不适合进行基因表达谱的监控。中国东南大学发明了分子印章法原位合成DNA，即采用涂有单核苷酸的印章多次压印在同一位置上。

方法四

美国NimbleGen公司用独特的光导合成化学结合无掩膜阵列合成技术(MAS)。MAS系统包括无掩膜的光发射机、反应腔、DNA合成仪和电脑等，系统的核心是一个数码微镜装置(digital micromlrror device，DMD)，创造了虚的掩膜代替传统的物理掩膜。这些“虚的掩膜”能反射紫外光的模式，该模式通过选择性地在精确位置上切割紫外标记的保护基团来去保护新生寡核苷酸，并使下一个碱基加上去。这种方法可以合成长达60个碱基的寡核苷酸片段，一张芯片上可以合成38万个寡核苷酸。