猴胚胎干细胞的分离及建系

实验概要

猴胚胎干细胞（monkey Embryonic Stem Cells，monESCs）的分离及建系

主要试剂

重组人卵泡刺激素（recombinant human Follicle Stimulating Hormone，rhFSH）、hCG、豚鼠补体、抗猴全血清、TL-HEPES、0.5 mg/mL的透明质酸酶电激活液、细胞基础培养液、0.5%链蛋白酶、2 mM 6-DMAP的CMRL-1066培养液、卵母细胞成熟液HECM-9培养液、monES培养液、复方氯胺酮

主要设备

注射器、35 mm培养皿、100 mm培养皿、巴斯德管、4孔培养板、内窥镜、负压泵、体视镜、电融合仪、超声影像工作台

实验材料

成年恒河猴或食蟹猴胚胎
！注意：严格按非人灵长类动物实验规范操作，符合非人灵长类动物实验伦理学要求，尽量减少动物的使用数量，尽量避免动物的损伤。

实验步骤

（1）促排卵
①按照已报道的促排卵操作流程，为生理周期第1-4天正常的成年雌性恒河猴每日两次肌肉注射18～30U rhFSH，持续7～9天。
②在最后一天采用超声影像确定此时雌猴卵巢中卵泡的成熟情况，卵泡直径大于3mm表示雌猴已成功应答卵泡刺激，再对其注射1000 UhCG，促进卵母细胞成熟。
（2）取卵
在注射hCG 27～34 h后，对促排卵雌猴使用复方氯胺酮进行麻醉，并采用卵泡穿刺手术取得成熟的卵丘卵母细胞复合体。
（3）培养及成熟
①将所取卵母细胞放于缓冲液TL-HEPES中，可以分辨出不同发育时期的卵细胞。
②将未成熟卵（GV期卵，MI期卵）放在卵母细胞成熟液中培养24～48 h使卵成熟。
③将已成熟的卵母细胞放在HECM-9培养液中培养，以备进行经卵胞浆内单精子注射（(Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）或孤雌激活。
（4）孤雌激活
受精胚胎由于精子的进入诱发卵母细胞内Ca² 的升高，引起皮质颗粒释放，使卵母细胞进入分裂间期。处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞在某些物理和化学因素的作用下，不经过受精，直接完成第二次减数分裂并发生卵裂，形成早期胚胎的发育过程称为孤雌激活，形成的胚胎称为孤雌胚胎。常用的激活方法主要有电激活和化学激活两种。电激活是利用瞬间电脉冲，在细胞膜上暂时形成许多微孔，使激活液介质中的Ca² 通过微孔进入胞质，可模拟受精过程，激活卵母细胞。化学激活法是利用化学激活剂，将细胞外Ca² 离子转运到细胞内，或动员细胞内钙库释放Ca² 离子，使细胞内Ca² 离子浓度升高，激活卵母细胞。其中，电激活的方法应用更为广泛。
①将成熟的的卵丘卵母细胞复合体短暂（<1 min）转移至0.5 mg/mL的透明质酸酶中，并用移液管反复吹吸使颗粒细胞脱落，挑选出形态完整、胞质均匀、有第一极体的卵母细胞用于激活。
！注意：在透明质酸酶中的时间不要超过1 min。
②将卵母细胞在电激活液中预平衡5 min，然后将卵母细胞放在融合仪的融合槽中，正负电极之间，采用200 V/mm 40 μs的直流脉冲进行电激活。
！注意:卵母细胞切勿直接接触电极。
③将卵母细胞转移至预先配制好的含有5 μM离子霉素的TL-HEPES液滴中静置4 min。
④在TL-HEPES液中清洗3次后转移至含2 mM 6-DMAP的CMRL-1066培养液中培养5 h。
⑤激活后的卵母细胞在HECM-9培养液滴中清洗3次，并转移至HECM-9培养液中培养。
（5）获得囊胚
对激活后的卵母细胞隔天更换新的HECM-9培养液滴，连续培养至第6～8天出现囊胚，一般认为囊胚出现时间越早质量越好。
（6）免疫外科法分离胚胎干细胞
①用0.5%链蛋白酶做成滴，把囊胚用口吸管转移到0.5%链蛋白酶的滴中作用1 min左右去除透明带。
②用抗猴全血清原液处理无透明带胚胎30 min，于培养箱中孵育，以去除滋养层细胞。
③用细胞基础培养液洗一遍。
④将胚胎孵育在含几内亚猪补体的细胞基础培养液（1：5，vol/vol）中30 min，。
⑤将滋养层部分溶解的细胞用巴斯德管反复轻柔吹打数次。
⑥将ICM用含细胞基础培养液洗涤3次。
⑦将分离出的ICM接种于4孔培养板中的饲养层细胞上，用monESCs培养液培养。
⑧每日更换新鲜的monESCs培养液克隆形成。
⑨最初几代需用机械切割的方式进行传代。