PK-120 的纯化及肽段氨基酸序列分析实验

PK-120

Q-Sepharose 树脂 S-Sepharose 树脂 Hudroxyapatite 羟基磷灰石 Sephacryl S－200 凝胶 赖氨酸内切酶 乙腈 三氯醋酸

Applied Biosystems model 477A 气相蛋白质测定仪 Applied Biosystems model 120A PTH 分析仪 反相高压也像系统 uBondasphere S-5 C8 300A 柱（2.1 mm×150 mm） TSK-GEL ODS-120T 柱（4.6 mm×150 mm）

1. PK－120 的纯化

1.1 聚乙二醇组分制备

枸橼酸磷酸右旋糖杭凝人血浆 500 ml， 使其含有 1 mol/L PMSF（蛋白酶抑制剂），0.1 mg/ml polybrene，100 mmol/L 赖氨酸，8 mmol/L BaCl₂， 然后加入 25 g 聚乙二醇 4000（PEG），搅拌 30 min ，6000 r/min 离心 10 min，离心沉淀溶于 200 ml 含 1 mmol/PMSF，0.01 mg/ml SBTl（大豆来源的胰蛋酶抑制剂），2 ug/ml FUT－175，10 mmol/L 赖氨酸，20 mmol/L Tris－HCl 缓冲液（pH 7.4）， 以 15％ PEG 再沉淀。6000 r/min 离心 10 min，以相同缓冲液 300 ml 溶解沉淀，置 4℃ 备用。以下柱层析操作中的缓冲液都含有上述蛋白酶抑制剂。

1.2 Q-Sepharose 柱层析

柱体积为 4 cm×27 cm，预先用含 10 mmol/L 赖氨酸 20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）平衡，将上述制备的血浆 PEG 组分上样，流速为 190 ml/h。先用 500 ml 平衡缓冲液洗脱，洗去未吸附的杂蛋白，然后用含 0.05～0.2mol/L NaCl 的缓冲液（总体积为 1000 ml），线性洗脱，收集的各组分和 PK（血浆激肽释放酶）在 37℃ 下，温孵 30 min，进行 SDS-PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色，被 PK 水解的 120 kDa 蛋白为 PK-120，制备抗体后，用双向免疫扩散法或免疫印迹法进行检测，从而鉴定含有 PK-120 的蛋白组分

1.3 S-Sepharose 柱层析

将上述得到的 PK－120 组分中加入 PEG， 终浓度达 20％， 用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.0， 离心回收沉淀，用含 10 mmol/L EACA（氨基己酸、50 mmol/L 醋酸钠缓冲液（pH6.0）溶解沉淀，预先用相同缓冲液平衡 S-Sepharose 柱（2.5 cm × 13.5 cm），上样。充分冼脱，除去杂蛋白，用含 0.025～0.03mol/L NaCl 的缓冲液线性洗脱，流速 170 ml/h，PK－120 的鉴定方法同上。

1.4 HTP（羟基磷灰石）柱层析

用 10 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 7.4）平衡 HTP 柱（1.8 cm × 10 cm）。PK-120 组分上样，用 20 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 7.4）洗脱，流速 120 ml/h。

1.5 Sepharyl S-200 凝胶过滤柱层析

上一步骤得到的 PK-120 组分，用 Centriflo membrane（25kDa cutoff；Amicon）浓缩，以含 0.1mol/L NaCl，0.1％NaN₃，50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）平衡 Sepharyl S-200 柱（2.4 cm × 63 cm）。上样，洗脱，流速 20 ml/h。由此得到的 PK-120 作为纯化样品供以下实验用。

2. 分离纯化肽段及测定氨基酸序列

纯化的 PK-120 温孵，37℃ 30 min（酶与底物的比例为 1:50）。用 0.1 mol/L NaCl，Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）平衡 Sepharyl S-200 柱（2.4 cm × 63 cm）。上样。由 PK 水解 PK-120 产生的 70kDa 和 35kDa 分别来自 PK-120 的 N 末端和 35kDa 片段经赖氨酸内切酶水解测定的多肽序列 C 末端。由 C 末端来源的 35kDa 经吡啶乙基化（S-pyridyethylation）还原反应，再用赖氨酸内切酶水解，37℃，16 h（酶与底物的比例 1:50）。上样反相高压液相 BondasphereS-5C8 300A 柱，流动相为水-乙腈-0.1％TFA，收集各组分，进一步上样方向高压液相 TSK-GEL ODS-120T 柱进行层析分离，收集洗脱各肽段，用 Applied Biosystems model 477A 气相蛋白质自动测序仪/Applied Biosystems 120 APTH 分析仪以 Edman 降解法对分离肽段 N 末端进行氨基酸序列分析，结果如图所示。