玉米转录因子和籽粒重要转录因子互作协同调控醇溶蛋白
玉米（Zea mays）原产于墨西哥和中美洲地区，是一种由古印第安人（Indians）在数千年前利用野生墨西哥类蜀黍（Euchlaenamexicana）（现存在于墨西哥和尼加拉瓜）杂交而来的品种。但是，作为一类重要的粮食作物，天然玉米籽粒在其营养价值上却有着重要的缺陷。根据已有的文献报道，玉米籽粒中，含量最大的储藏性蛋白——醇溶蛋白中，赖氨酸和色氨酸这两种人类必需的氨基酸含量严重缺乏，导致玉米籽粒整体营养价值不佳。因此，如何能够提高玉米籽粒的营养价值就成为现代社会人类需要解决的一个重要课题。
有报道，玉米籽粒特异的 bZIP 类转录因子 Opaque2（O2） 在籽粒发育过程中起到关键作用。Opaque2（o2） 突变体相对于野生型籽粒而言表现出了显着的粉质胚乳的表型。有研究表明，O2 基因可以结合 22-kD α-zein 醇溶蛋白启动子的 O2 motif（TCCACGTAGA）从而调控该基因家族的表达。除此之外，19-kD α-zein、14-kD β-zein、27-kD γ-zein 和 50-kD γ-zein 同样都是 O2 基因的调控对象，其最保守的结合结构域为 TGACGTGG.O2 基因在玉米籽粒营养代谢中的价值巨大，与其有关的方方面面都被人们关注。但是，其转录后调控的研究却始终没有较全面的进展，以至于始终没有深入的挖掘其生物学功能。
上海大学的研究人员通过对 Opaque2 的酵母双杂交（Yeast two-hybrid screening）技术对其互作蛋白进行筛选以及功能分析，从而对 Opaque2 调控下游基因的表达的理论模型做出了进一步的解释和完善。该研究成果已经被国际着名学术期刊杂志 PLOS Genetics 接收，即将在线发表。该研究是上海大学通信学院的博士研究生乔祯逸在宋任涛教授和生命学院青年教师祁巍巍博士的指导下完成的。该研究中 RNA-Seq 服务由上海伯豪生物技术有限公司提供。
研究思路
研究结果
1. 研究人员利用酵母双杂交技术对 O2 蛋白的互作蛋白进行筛选，以期望能够拓展 O2 在籽粒发育时期起到的作用机制。在酵母双杂交实验中，研究人员筛选到一个属于 MADS 类转录因子家族的蛋白 ZmMADS47,并且该蛋白与 O2 之间的互作通过 GST Pull-down、coIP 以及凝胶过滤实验的验证（图 1）。
2.ZmMADS47 与 O2 的表达谱分析
研究人员对 ZmMADS47 的全长蛋白以及分段蛋白进行了转录激活能力的检测。结果发现， ZmMADS47 的 C 端不保守结构域则表现出了极强的转录激活能力（图 2）。该结果中，ZmMADS47 全长则仅仅表现出了较弱的转录激活能力。这可能是由于 ZmMADS47 的 C 端转录激活结构域被全长包裹其中使得其转录激活能力的不到释放，而在酵母体系中又缺乏一些能够使其转录激活能力得以释放的因子，从而导致 ZmMADS47 全长在酵母中相对于玉米籽粒天然状态中的构型与修饰存在差异，从而影响了全长的转录激活能力。
3.ZmMADS47 RNAi 株系的转录组表达谱分析
为了对 ZmMADS47 RNAi 后整体基因表达水平进行一个大致的了解，研究人员使用了上海伯豪的玉米 mRNA 高通量测序服务对 ZmMADS47 RNAi 籽粒的模式进行转录组层面的研究。GO 归类后发现，差异基因主要被归类于营养储藏类（表一）。
4.ZmMADS47 RNAi 籽粒的表型观察
qPCR、SDS-PAGE、Western-blot 对醇溶蛋白 RNA 和蛋白水平的研究发现，α-zein 和 50-kD γ-zein 的积累量都出现了一定程度的下降。但与 o2 突变体的 opaque 表型不同的是，ZmAMDS47 RNAi 籽粒中并没有出现明显的 opaque 表型（图 3）。
5. 蛋白体大小与形状在 ZmMADS47 RNAi 籽粒中发生变化
研究人员对 ZmMADS47 RNAi 籽粒进行了透射电镜的观察，结果表明，突变体的蛋白体大小分配上出现变化，并且部分蛋白体出现畸形（图 4）。
6.ZmMADS47 可以结合醇溶蛋白启动子
研究人员对 ZmMADS47 和醇溶蛋白启动子的体外结合研究发现，ZmMADS47 可以结合α-zein 和 50-kD γ-zein 的 CATGT 启动子，并且和 O2 一同调控醇溶蛋白的表达（图 5）。
7.ZmMADS47 促进 O2 调控醇溶蛋白表达
ZmMADS47 与 O2 瞬时转化洋葱表皮细胞后发现，ZmMADS47 本身单独不能激活下游靶标，而与 O2 一同转化后，则可以不同程度的增加下游靶标的转录激活能力（图 6）。
8.O2 释放 ZmMADS47 的转录激活能力
研究人员通过对 ZmMADS47,O2 以及 50-kD 醇溶蛋白的突变研究表明，O2 可以通过和 ZmMADS47 的蛋白互作释放 ZmMADS47 C 端的转录激活能力，从而促进下游醇溶蛋白的表达（图 7）。
讨论
本研究中，研究人员通过对 Opaque2 蛋白的酵母双杂交筛库筛选到了一个 MIKC 亚类的 MADS 类转录因子 ZmMADS47.对 ZmMADS47 进行 RNAi 后的转录组研究发现，ZmMADS47 同样对醇溶蛋白存在着调控关系。体外 DNA-蛋白互作（EMSA）实验证实 ZmMADS47 对α醇溶蛋白以及 50-kD γ-zein 有着直接结合。ZmMADS47 与 Opaque2 的瞬时转录激活测试表明，Opaque2 可以释放 ZmMADS47 的转录激活能力，从而一同增强对α醇溶蛋白以及 50-kD γ醇溶蛋白的调控。该研究成果不仅大大拓展了人们对玉米籽粒醇溶蛋白调控机制的认识，还对植物 MIKC 亚类 MADS 类转录因子在植物发育过程中的生物学功能有了进一步的延伸。
原文出处：Qiao ZY, Qi WW, Wang Q, et al. ZmMADS47 regulates zein gene transcription through interaction with Opaque2. PLOS Genetics.2016.
