荧光显微镜检测支原体

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荧光显微镜检测支原体

2019.10.20

实验方法原理	检测支原体有两种不同的策略：第一种方法将在下述方案中述及，利用对 DNA 染色的荧光染料 Hoechst 33258, 它对细胞核周围（在细胞表面或胞质中）的特殊物质进行染色，可显示支原体污染；第二种方法是利用 DNA 探针识别细胞提取物中的 DNA 支原体特异序列，进行支原体污染的检测。对这个方案，照试剂供应商（fisher Scientific) 的说明进行。
实验步骤	1) 准备下列液体，然后除菌并冷藏。无酚红的 HBSS NaCl 8 g KCl 0.4 g CaCl₂ 0.14 g MgSO₄•7 H₂O 0.1g MgCl₂•6 H₂O 0.1g Na₂ HPO₄•2 H₂O 0.06 g KH₂PO₄ 0.06 g 葡萄糖 1.0 g NaHCO₃ 0.35 g dH₂O 1000 ml Hoechst 1000x 贮存液柠檬酸/磷酸盐缓冲液（2X) 0.1mol/L 柠檬酸 22.2 ml 0.2mol/LNa₂ HPO₄ 27.8 ml 用柠檬酸或 Na₂ HPO₄ 调节 pH 为 5.5。 2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。 3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面，让细胞生长 2~3 天。 4) 准备 Camoy 固定液（应在每次用前制备新鲜的)。 Camoy 固定液 3 份甲醇 1 份冰乙酸 5) 吸干培养液，不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液（约 5 ml）室温中放置平皿 2 分钟。 6) 去除培养皿中液体，加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中（约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。 7) 重复歩骤 6。 8) 去除固定液，去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出，让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。 9) 用 Hoechst1000x 储存液（步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。 Hoechst 工作液工作液宜每次新鲜配制用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液（0.5ug/ml) 用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液（0.05ug/ml) 或用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液；每 Coplin 染缸中加人 40 ml。 10) 室温条件下，在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液（终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。 11) 用 dH₂O 漂洗两次。 12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液（在步骤 1 中制备），制备封闭培养液以覆盖住细胞。 13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液，用纸巾轻轻吸出多余液体。 14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。 15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。展开

实验方法原理

检测支原体有两种不同的策略：第一种方法将在下述方案中述及，利用对 DNA 染色的荧光染料 Hoechst 33258, 它对细胞核周围（在细胞表面或胞质中）的特殊物质进行染色，可显示支原体污染；第二种方法是利用 DNA 探针识别细胞提取物中的 DNA 支原体特异序列，进行支原体污染的检测。对这个方案，照试剂供应商（fisher Scientific) 的说明进行。

实验步骤

1) 准备下列液体，然后除菌并冷藏。

无酚红的 HBSS

NaCl                             8 g
KCl                               0.4 g
CaCl₂          0.14 g
MgSO₄•7 H₂O            0.1g
MgCl₂•6 H₂O         0.1g
Na₂ HPO₄•2 H₂O         0.06 g
KH₂PO₄                 0.06 g
葡萄糖              1.0 g
NaHCO₃                  0.35 g
dH₂O                 1000 ml

Hoechst 1000x 贮存液

柠檬酸/磷酸盐缓冲液（2X)

0.1mol/L 柠檬酸             22.2 ml
0.2mol/LNa₂ HPO₄           27.8 ml
用柠檬酸或 Na₂ HPO₄ 调节 pH 为 5.5。

2) 滴人 1~2 滴胰蛋白酶消化细胞于培养皿中的 Labtek 玻片上或盖玻片。

3) 加人 1~2 ml 培养液覆盖表面，让细胞生长 2~3 天。

4) 准备 Camoy 固定液（应在每次用前制备新鲜的)。

Camoy 固定液
3 份甲醇
1 份冰乙酸

5) 吸干培养液，不用洗涂单层细胞并直接加人 Camoy 固定液于 Labtek 室内或培养皿中。培养皿中充满 Camoy 固定液（约 5 ml）室温中放置平皿 2 分钟。

6) 去除培养皿中液体，加人新鲜固定液以充满室内或培养皿中（约 5 ml)。室温中放置平皿 5 分钟。

7) 重复歩骤 6。

8) 去除固定液，去除 Labtek 室的塑料外套或将培养皿的玻片拿出，让细胞在室温中晾干 30 分钟或更长。

9) 用 Hoechst1000x 储存液（步骤 1) 配制 Hoechst 工作液。

Hoechst 工作液

工作液宜每次新鲜配制

用 10ml HBSS 稀释 0.1 ml Hoechst 储存液（0.5ug/ml)

用 5 ml HESS 稀释 0.5 ml Hoechst 储存液（0.05ug/ml)

或

用 50 mlHBSS 稀释 50ul Hoechst1000x 储存液；每 Coplin 染缸中加人 40 ml。

10) 室温条件下，在 HBSS 配制的 Hoechst 工作液（终浓度为 0.05ug/ml) 中染色玻片 10 分钟。

11) 用 dH₂O 漂洗两次。

12) 等体积混和甘油、梓檬酸/磷酸缓冲液（在步骤 1 中制备），制备封闭培养液以覆盖住细胞。

13) 在玻片和盖玻片之间加入 2 滴封闭培养液，用纸巾轻轻吸出多余液体。

14) 用橡胶黏合剂封闭玻片和盖玻片。

15) 用荧光显微镜观察标本。应用激发波长为 330/380nm 和光栅过滤器 LP440nm。

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