手性色谱与质谱联用对精神药物的精准检测
利用手性色谱与质谱联用对精神药物安非他明和甲基安非他明进行生物检测。甲基安非他明和安非他明是强效中枢神经兴奋剂，在使用方面有许多道德问题：会对提高信心、增加社交性和能量方面产生副作用，如作为娱乐精神药物被过分使用。由于其对提高精神警觉性和抑制疲劳具备增强作用，导致体育领域药物滥用，会引起高血压和心动过速等副作用。安非他明的副作用要小于甲基安非他明，但在不受控制的药物滥用情况下，两者产生的效果非常类似。
目前，这些药物滥用程度依然非常高。英国公共卫生部报告指出，2012年注射药物安非他明和安非他明类物质的人数是2002年的几乎3倍之多。另外，与挥发性较弱的硫酸安非他明不一样，盐酸安非他明(亦称“冰”和“冰毒”)可以被吸食，这方面与可卡因类似，但效果持续时间更长。据报道，通常情况下，不会对安非他明和甲基安非他明进行共同的常规检测，因此哪种药物使用更广泛的信息少之又少。需要注意的是，在亚洲和北美，甲基安非他明比安非他明更容易获取，在欧洲，则反之。
手性
安非他明和甲基安非他明都是手性分子(如图1)。一般情况下，两种药物的D型异构体比L型异构体的生物活性更强。尽管甲基安非他明是受控制物质，其L型异构体事实上用于几种非处方药中(如北美的吸入制剂Vicks®)，在一定程度上会改变药物滥用所引起的真实水平的提升。事实证明，L-甲基安非他明也是几种治疗性药物的代谢产物，如司立吉林(早发性帕金森氏症、抑郁和痴呆的治疗药物)。安非他命的定量既复杂又简单(甲基安非他明的主要代谢产物)。传统的药物分析方法：免疫测定法，并不能区分异构体，很容易给出不完整和不确定的结果。
非法出售甲基安非他明，通常是D型异构体或消旋体。根据纯度和异构体组成，一个当量的产品可被吸收的药物量从几十毫克到几百毫克不等，并代谢为安非他明和4-羟基甲基安非他明。安非他明代谢物主要是1-苯基-2-丙酮，其次为4-羟基安非他明。然而，口服摄入后，高达54%的甲基安非他明和10-23%的安非他明被排出，这通常是被监测的母体药物。
图3 不同浓度流动相添加剂条件下甲基安非他明信噪比
确定非法使用安非他明和甲基安非他明的罪责，在于能够区分对被测滥用产品的贡献和L-对映体的可能替代来源。因此，对于检测来说，将对映异构体分离开来是更精确的方式。手性分离方法也可以用来指示非法来源所使用的合成路线，有助于刑事调查。
分析方法开发
因其更大的灵活性，可满足化合物毒理学研究需求，LC/MS/MS方法正逐渐成为分析方法的首选。另外，包括手性GC方法和手性LC方法都可用于生物检测。
GC方法不可避免包括这些类型分子的衍生化，通常作为三氟醋酸盐在手性GC固定相上进行分离。通常来讲，HPLC的样品前处理和方法开发相对来说更简单一点，更适合生物样品的分析。本文开发HPLC分析方法，并对分辨率、保留和LOQ进行优化。
HPLC方法开发
Astec® CHIROBIOTIC® HPLC手性固定相(CSPs)基于键合的大环糖肽，具备良好的质谱兼容性，且对极性分子适用性强，因此选择此类色谱柱进行方法开发。另外，在临床和司法应用方面，Astec CHIROBIOTIC CSPs的优势在于稳定性和耐受生物样品的能力，而其他的CSPs无法承受如此的条件。Astec CHIROBIOTIC CSPs在反相和极性离子流动相(有机改性剂与水占比>90%，离子添加剂比例<10%)条件下，均可表现出手性选择性。
甲基安非他明通过反相和极性离子流动相两种模式进行分离，后者表现出更强的选择性(添加剂包括醋酸/氢氧化胺和三氟乙酸胺，均进行优化)。
极性离子固定相分离模式的经典选择是100%有机相，尤其是非水流动相，除此之外，可以添加最多10%水(保证分离模式不转换为反相模式)，进行分离。在极性离子分离模式下，添加剂通常是一种酸、碱和挥发性盐，作用是增强CSP可离子化表面的离子作用力，同时有助于质谱中分析物离子化的稳定性。在此种分离模式中添加至多10%的水，有助于提高离子添加剂的溶解性，保证分析方法的稳定性和重现性。
相对于所有的手性固定相，Astec CHIROBIOTIC的分离机理更像是混合模式。大环糖肽表面包含许多可能的作用位点，如亚胺(多肽)、苯酚、离子(氨基或羧基)和芳香氯基团，以及络合空腔。Astec CHIROBIOTIC V2采用万古霉素作为手性键合相，其含有羧基，因此适用于一些亚胺类分子的分离。其他功能基团通过氢键作用来增强分离效果。
甲基安非他明异构体的分离检测
一根Astec CHIROBIOTIC V2(15 cm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱在两种极性离子流动相条件下对比保留和分辨率。两种条件均是甲醇：水=95：5。第一种流动相采用醋酸和氢氧化铵(0.1：0.02)作为离子添加剂。第二种采用三氟醋酸铵。两种条件下，均取得了基线分离，D-或 S(+)异构体先于L-或 R(-)异构体流出。三氟醋酸铵作为离子添加剂条件下，保留和分辨率均较低。
稍后对两种离子添加剂条件下的检测灵敏度作比较。经过对比信噪比，采用醋酸/氢氧化铵作为添加剂可获得更低的定量限(<12.5 ng/mL)，因此选择该流动相体系作为优化后的检测条件。建立定量曲线，R(-)-甲基安非他明在12.5到240 ng/mL之间是线性相关的。将相同的色谱条件用于安非他明的检测，同样取得高分辨率，保留弱于甲基安非他明。
同时分析安非他明和甲基安非他明
尽管这些化合物的重要性不一，寻找能够同时对这四种异构体进行基线分离的方法依然很重要。采用前面优化好的色谱分析方法对四种异构体进行分析，其中两种物质共流出。虽然质谱检测器可以有效识别出这些交叉色谱峰，依然对分析条件进行优化。研究酸/碱比例对分辨率的影响，以及将CHIROBIOTIC V2换成CHIROBIOTIC V(键合相一致，键合化学有差异)所造成的影响。但是，这些优化均未能实现四种异构体的基线分离。通过简单的增加色谱柱长度和提高分析温度，成功实现四种异构体的基线分离。
样品制备的重要性
有效的样品制备可以去除基质干扰，提高分析方法的灵敏度和稳定性。如下是液液萃取LLE和固相萃取SPE分别应用在尿液中萃取甲基苯丙胺的方法对比。
液液萃取LLE
125μL尿液中加标甲基安非他明(异构体浓度均为125ng/mL)和1mL二乙醚。涡旋震荡30分钟后，10000转离心机离心10分钟，取上层有机溶液500μL, 55℃氮吹至干，500μL流动相复溶，0.22PVDF滤膜过滤，上样分析。
固相萃取SPE
SPE方法中，1mL尿液中加标甲基安非他明(异构体浓度均为25ng/mL)，甲酸调pH 3-4。使用Supel™-Select SCX SPE 96孔板 (30 mg/well，575664-U)，1 mL 1%甲酸的乙腈溶液和1 mL纯水先后预处理96孔板，加入1 mL尿样。依次用2 mL水、1 mL 25%甲醇淋洗。用1 mL 5mM磷酸氢二胺的50%甲醇溶液清洗苯甲胺，最后用1 mL 10%氢氧化铵的乙腈溶液洗脱目标化合物。40℃氮吹至干，1 mL流动相复溶，备用。
如图6所示，对比液液萃取LLE和固相萃取SPE的分析结果，SPE法得到的萃取液更为干净，去除了几乎所有基质的干扰，提高了目标分析物的回收率。
溶剂
溶剂等级不同，其所含有的杂质含量不同， LC-MS分析时会产生不同的基线背景和噪音，影响检测的灵敏度。为保证高灵敏度的LC/MS分析，需采用高级别的溶剂(参考图7)。
结论
Astec CHIROBIOTIC V2以万古霉素作为固定相可以为甲基安非他明和安非他明等四种手性异构体提供快速和基线分离的分析方法。采用极性离子流动相模式，在甲醇/水体系中加入醋酸/氢氧化铵，可以为安非他明和甲基安非他明提供灵敏和高通量的手性分离方法。该方法具备低LOQ和高分辨率等优点。采用Supel-Select SCX SPE进行样品前处理可以去除掉尿液基质中的复杂干扰物。而且该样品前处理和LC/MS分析方法易于转移。
