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普通PCR、实时荧光定量PCR和数字PCR对比分析（二）

2020.4.20

模板 DNA 量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板浓度与 Ct 呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品 Ct 值，就可以计算出样品中所含的模板量。

目前常用荧光标记方法

方法	优点	缺点	应用范围
SYBR Green I	适用性广灵敏方便便宜	引物要求高易出现非特异条带	科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物研究
Taqman	特异性高重复性好	价格高只适合特定目标	病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病诊断
分子信标	高特异性荧光背景低	只适合特定目标设计困难价格高	特定基因分析，SNP分析

荧光定量 PCR 反应体系举例
试剂	含量
2xGoTaq Master Mix	5µl
无核酸酶水	3.5µl
上游引物	0.25µl
下游引物	0.25µl
基因组 DNA	1µl（约20ng）梯度稀释
共 10µl

仪器与耗材

在普通 PCR 仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量 PCR 仪。其 PCR 扩增原理和普通 PCR 仪扩增原理相同，只是 PCR 扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出，把这 PCR 仪叫做实时荧光定量 PCR 仪 (qPCR 仪)。荧光定量 PCR 仪有单通道，双通道，和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测，生物医药研发，食品行业，科研院校等机构。

实时荧光定量 PCR 与普通 PCR 对比

	实时荧光定量 PCR	普通 PCR
检测	荧光检测	电泳跑胶
特异性	引物和荧光探针，特异性高	引物，特异性低
灵敏度	荧光检测灵敏度高	电泳检测相对较低
自动化程度	无需跑胶，自动化程度高	结束后再跑胶
结果	全程监控，准确的算法进行定量	定性
污染	封闭体系，环境污染少	污染可能性大

应用

定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，SNP 分析等。

绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量分析，GMO 定量检测等。

相对定量研究：mRNA 表达分析，siRNA 效果确认，差异显示结果验证等。

1992 年，Sykes 等从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞，检测了复杂背景下低丰度的 IgH 重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则：有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理，为以后 dPCR 的发展奠定了基础，逐步拉开了 Digital PCR 研究和应用的序幕......

参考文献：