（5）垂死的肿瘤细胞释放的PGE2促进TRC的增殖
如前所述，垂死的肿瘤细胞能促进报告细胞的增殖，这暗示着TRCs被除了外泌体miR-194以外的物质驱使加速了增殖。众所周知，受辐射的垂死肿瘤细胞还释放了PGE2，这是一种脂质代谢产物，被认为是化学放疗后肿瘤重生的重要介质。因此，作者通过ELISA定量了受辐射的垂死胰腺癌细胞中的PGE2，发现放射后24小时PGE2含量保持不变，但在48小时略有升高，而在72小时显著增加（图5a）。
同样，PGE2形成的关键酶PTGS2（COX-2）的表达也经历了短暂的滞后阶段，之后逐渐增加（图5b-c）。而辐射后，胰腺癌细胞中，外泌体相关蛋白（如RAB27A，TSG101和CD9）的表达立即增加（图5c）。值得注意的是，当COX-2的表达逐渐增加时，外泌体相关蛋白的表达减少（图5c）。在PDX小鼠模型中，IHC染色还显示，放射后不久，外泌体相关蛋白的表达升高，直到12天后下降，此时COX 2的表达开始显著上调（图5d）。
同时，发现 celecoxib（一种抑制PGE2合成的COX-2抑制剂）以剂量依赖性方式显著抑制了肿瘤细胞的繁殖（图5e）。虽然PGE2可以加速肿瘤细胞的增殖，但是在放射后立即向肿瘤细胞中添加PGE2会反向抑制细胞活力（图5f）。值得注意的是，celecoxib处理并不会影响外泌体相关标志蛋白质的表达（图5g）。这些结果表明，辐射的垂死肿瘤细胞分泌的外泌体对于肿瘤的再形成至关重要。
综上，这些结果表明，垂死的肿瘤细胞释放的外泌体和PGE2共同作用导致了肿瘤的再增殖级联反应，其中外泌体miR-194-5p首先抑制细胞增殖以促进TRC的恢复，然后PGE2促进TRC的加速增殖。

图5：垂死的肿瘤细胞释放的PGE2促进回收的TRC的增殖
 

（6）阿司匹林通过削弱垂死的肿瘤细胞的分泌物来抑制放疗后的肿瘤
作者前期研究推测，阿司匹林可能具有抑制胰腺癌中肿瘤再增殖的潜力，前人研究也表名其会影响外泌体和miRNA。因此，作者首先在体外测试了阿司匹林治疗在肿瘤细胞重塑模型中的作用。发现阿司匹林极大地抑制了与辐射的垂死肿瘤细胞共培养的报告细胞的增殖（图6a），而当它们单独培养时对报告细胞的增殖没有影响。阿司匹林降低了辐射的胰腺癌细胞上清液中的PGE2含量（图6b），并减少了细胞释放的外泌体的量（图6c）。此外，在阿司匹林处理过的辐射细胞衍生的外泌体中，miR-194-5p被下调（图6d）。与仅接受放射线处理的细胞分泌的外泌体相比，经阿司匹林处理的辐射细胞衍生的外泌体丧失了诱导G1 / S阻滞并减少EdU掺入的能力（图6e-f）。因此，经阿司匹林处理的辐射细胞产生的外泌体在辐射后不能促进胰腺癌细胞的集落形成（图6g）。
接着，作者又在PDX小鼠模型中测试了阿司匹林治疗的效果。阿司匹林单一疗法对PDX肿瘤无治疗作用，单独放疗同样无治疗作用（图6h-i）。然而，阿司匹林治疗和放射疗法的结合显著抑制了肿瘤的重新聚集并延长了荷瘤小鼠的存活时间（图6h-i）。此外，阿司匹林损害了放疗后肿瘤组织的恢复，这与GW4869的作用相似。同时，阿司匹林还抑制了放疗后肿瘤组织中ALDH1A1+ TRC的富集。这些数据表明，阿司匹林可抑制胰腺癌放疗后的肿瘤再增殖。

图6：阿司匹林通过削弱垂死的肿瘤细胞的分泌物来抑制放疗后的肿瘤

总结

总的来说，本研究通过全转录组测序（云序提供）和外泌体miRNA测序（云序提供），鉴定显著变化的miRNAs。并采用qPCR、Western blot、IHC、FACS、集落形成等实验进行分子和细胞分析，发现垂死肿瘤细胞来源的外泌体通过传递miR-194-5p诱导G1/S期阻滞，促进DNA损伤反应，提高TRCs的存活率，进而调节E2F3的表达。此外，外泌体miR-194-5P可减轻放疗时致癌HMGA2的毒副作用。在潜伏一段时间后，垂死的肿瘤细胞进一步释放大量的PGE2来恢复TRCs的增殖，并协调了再增殖的级联反应。值得注意的是，该研究发现小剂量阿司匹林可以通过抑制外泌体和PGE2的分泌来抑制胰腺癌放疗后的再生长。

图7：阿司匹林破坏垂死肿瘤细胞分泌的外泌体导致的肿瘤再生级联反应
 

云序生物外泌体技术服务
云序生物拥有丰富的微量样本测序经验，为众多临床与基础科研研究者提供了高质量的科研服务，助力客户发表过众多微量样本的SCI文章，其中包含多篇外泌体文章。云序生物提供从外泌体提取、外泌体鉴定、外泌体全转录组测序、RIP、RNA pull-down和双荧光素酶报告实验等一站式服务，协助用户实现快速发表外泌体成果。