微板及酶免自动化概述（二）
第三章 微板设备
随着ELISA试剂的市场迅速发展，人们对处理微板的相关设备的自动化、精密度和高通量等的要求也越来越高。在ELISA实验中对实验过程、实验结果有影响的设备主要是涉及加样、加试剂、洗板、孵育、读数等相关部分，下面一一论述。
1. 加样设备
根据美国病理家协会（CAP）的调查报告，在实验室误差（ERROR）产生的原因中，有79%的因素是因为实验过程中样本处理不当造成的。区别于其他临床检验技术针对每一反应单元对应一份标本，酶免试验的样本处理和试剂的分配，必须基于96孔微板的批量化操作。为保障整板内各孔标本孵育时间的最小差异，必须采用8通道或12通道快速加样，以致于96通道。
首先是Dynatech公司推出的Dynadrop SR，配有八个分液通道的手动注射分液装置，可以进行25或50 ul试剂的分配。后期又推出The 96-Channel Autopipetter，是配有96通道的专为微板设计的半自动的分液器，可以同时吸取并分配96份25或50 ul的试剂至微板中。
Dynatech公司的Dynadrop MR可以通过12个分配头连续分配相同或不同的试剂。
Titertek Autodrop是一台由微电脑控制的分配器，能够自动控制配液量并自动推进微板孔，分配体积10-300 ul可选，于1981年在FDA登记注册。
Dynatech公司的Rotatiter手持微板移液器可配置多达12个郁金香花型循环分配器进行系列稀释。把此装置连续的放到连续的板孔中，由电动马达驱动进行连续稀释，分配体积为25和50 ul。
Dynatech公司生产的The auto III with SRD III，可以通过预先编程，在不同规格的微板可实现自动稀释器、分配器、吸液器上述三种功能。可以进行系列稀释，并可在微板孔中吸/注预定体积的试剂。
另一款自动稀释分配器是为更大容量的试管设计的，由微电脑控制，能够实现单个或系列稀释（FP-801采样器，芬兰赫尔辛基Labsystems Oy公司）
实验过程中，经常会遇到同一样本需要做多个检测项目，需要重复吸取样本，这就需要有传输装置可以从共同来源处吸取等量样本。为此，人们开始使用半自动96通道移液器进行转移，例如从共同来源补充或稀释红细胞，或从一块微板到另一块微板进行多个样本稀释。一个新的平行转移装置可以用于同时在微板间转移96个25或50 ul样本。
随着酶免试验的普及，加样设备的发展也经历从手动操作到自动化的过程，加样的精密度随之越来越高，更好的保障实验的准确性。从基于管路稀释分配器原理的样本处理机得到快速发展，先后有数家厂商开发了十余种样本处理机，以满足实验室液体处理需要。这其中又以瑞士Hamilton公司的产品为典型代表。
1947年，哈美顿股份公司（简称Hamilton公司）的创始者克拉克·哈美顿来到位于加州大学伯克利分校的放射实验室，师从于劳伦斯博士（1939年诺贝尔物理学奖得主，劳伦斯伯克利国家实验室）。在那里，他研究开发处理放射性物质的工具和设备，甚至包括手套箱。在此期间他发明了世界上第一支微量进样针，该款经典的进样针在60多年以后仍畅销于全世界各大分析实验室用于色谱法实验。1970年Hamilton公司推出了第一款半自动稀释器。1974年Hamilton公司开始研发自动化机器人，很快便在1980年成功创造出世界上第一台全自动液体处理工作站用于样本的制备。1994年，该公司Micrlab AT plus 酶标板样本处理机，具有全面的标本质量监测系统、加样质量保障系统和全过程控制（Total Process Control）系统，获得美国FDA许可，用于血液筛查实验室的产品。在中国自1996年开始引进AT样本处理机，迄今为止已有200余台。2001年瑞士哈美顿推出Microlab STAR液体处理工作站，首次采用气体置换技术。
2. 洗板机
ELISA分析试验中，洗涤是一个至关重要的异相处理步骤，通常人们称这一步骤为“洗板”，完成这一步骤的设备称之为“洗板机”。其本质是通过连续多次的洗液置换，以稀释和移除未反应的试剂和非特异性的杂质，降低背景值从而使分析获得更高的信噪比。洗涤不充分将会产生高的背景值，而过度的洗涤有可能会洗脱掉反应孔中的抗原-抗体复合物从而降低分析灵敏度。故从二十世纪七十年代引入了ELISA技术之后，科学家们不断地优化洗板方案、改善洗板质量，以求提高ELISA实验的敏感性和特异性。洗板方案演变至今，经历了以下几个阶段：手工洗板、简易洗板机、自动洗板机、集成全自动洗板机。
手工洗板通常是采用人工操作的方式，在每个孵育步骤后将微板孔内的反应液吸出或甩出，然后翻转微板，在吸水纸上轻拍以除去多余的残液，再注满洗液，放至两到三分钟后再将其吸出或甩干，再翻转微板在吸水纸上轻拍，根据要求循环3-5次。手工洗板残留量较低（拍干模式，残留量为0.5-1ul/well），能够有效的稀释和移除未反应的试剂和非特异性的杂质，但因其效率低，不能满足高通量的检测要求，并且由于操作人员熟练程度与操作手法的差异使得洗板步骤重复性差，从而影响检测结果。随着实验通量的增加、精度要求的提高，早期的一些公司推出了一系列仍需手工操作的简易液体分配器或洗板机以替代一部分手工操作。
如上世纪70年代中期，美国的M.A. Bioproducts公司推出的手动操作的“ELISA Wash
Dispenser”能够实现大体积洗液的定量分配，明显提高了手工洗板分配洗液的效率。
进入八十年代，美国Dynatech Laboratories公司生产的“Miniwash Washer-Aspirator”手动洗板机，采用手柄推动进板，拇指控制活塞来分液；Miniwash具有独立的吸液头，采用真空方式将反应液从微板孔中吸除，以替代手工拍板，并使完成一块微板的洗涤时间缩短到了几分钟。Miniwash另外还配置了一排8针的注液头，但由于需手工操作，分液时很容易溢出而导至孔间“串孔”。后来，Dynatech Laboratories公司对Miniwash进行改进，推出了半自动化的第二代洗板机Dynawasher II。Dynawasher II采用各自独立的8排12针的注液头和吸液头，放置在水平轨道左右两边的位置，分别实现注液和吸液，能够同时处理96孔微板的所有孔。同Miniwash相比，Dynawasher II能够自动控制分液的体积，解决了洗液溢出的问题。
几乎同一时期，Flow Laboratories公司将第一台全自动的洗板机Titertek® Multiwash 推向了市场。Multiwash配置了2排8针的洗板头模块，提供了三种不同的洗板程序，可通过简单的编程控制注液和吸液，克服了手动或半自动洗板机可能发生的注液不均和吸液不彻底的问题，这种全自动化的处理模式使洗板时间进一步减少到1分钟。1984年Bio-Tek公司推出其第一台全自动洗板机EL402。该洗板机速度更快，处理96孔微板的1个吸/注液的循环仅需要8秒，彻底洗涤一块微板的时间仅仅需要25秒，孔间的分液精确度也大有提高。除此之外，EL402也增加了一些提高洗板效率的功能，如：可供用户选择的浸泡时间，洗涤循环次数等。（Dual chamber microplate washer；United States Patent 4493896 ）
全自动洗板机问世30多年来，微板的应用也在不断地延伸，互相促进。如1992年诞生了第一块用于细胞培养的微板。在这30多年中，免疫分析技术也在不断地发展，如生物素-亲和素信号方法系统的应用、发光底物替代颜色底物、磁珠替代微板作为固相载体等。时至今日，洗板机已经不再是单纯的替代手工操作，也不仅是为了迎合高通量的需求。这一阶段为了提供良好的洗板环境，洗板机的发展强调得更多的是洗涤效果，而非自动化，洗板环境可以理解为利于改进洗涤效果参数及洗涤动作，全自动洗板机逐渐融合了冲洗压力、冲洗距离、冲洗时间、震荡、涡流、底部冲洗、两点吸液、交叉吸液和连续式冲洗等动作；并增加了更多兼容性，如384孔微板、深孔板、条板、磁板、滤板等不同用途不同规格的微板。Bio-Tek公司得益于自动化和微电脑技术的发展，开发的第四代洗板机ELx405TM，以其卓越的性能和优异的稳定性，成为集成全自动洗板机的代表。不但可以满足用户不同应用方向和检测通量的实验需求，还有更灵活的功能和更多型号可供选择。该时期的洗板机分液精确性、残留量等也得到了很大的提高，通过简单的面板操作，用户可以轻松编辑程序，完成既定洗板任务。
1992年，北京市海淀区天石医疗用品制作所（现北京天石天力医疗器械技术开发中心）研制出国内第一台全中文界面的自动洗板机ZMX系列。经过不断的技术改进，目前的ZMX-988B型全自动洗板机集成了多种洗板动作，在国内有较高的市场占有率。1993年起，北京拓普分析仪器有限公司起草了国内第一部洗板机行业标准，其公司上世纪90年代推出的微电脑控制的DEM-3型自动洗板机，现在仍然出现在国内洗板机市场上。
3. 孵育器
ELASA试验中，在加完样本、检测蛋白等之后通常将在37℃条件下孵育。37℃的孵育条件是使酶免反应在接近人体体温的环境中进行，从而保持蛋白原有的活性的条件下提高蛋白的扩散速度，在一定时间内使蛋白（抗原-抗体进）间进行充分的反应从而达到动态平衡以形成稳定的抗原-抗体复合物[19] 。在众多影响ELISA检测结果的因素中, 孵育温度对反应体系的影响是最为关键的因素之一。因此，不但孵育温度和孵育时间对于ELISA试验是至关重要的，并且孵育温度和时间的标准化对于ELISA的检测结果也有直接的影响。孵育温度控制的不精确或不均匀，都会影响到ELISA试验的分析性能。所以，从ELISA方法建立之初人们就一直在不同领域开展对孵育方式的研究与改进。
采用水浴箱进行水浴孵育是最早应用于ELISA试验的，其也是传统的ELISA孵育方法。由于水浴箱没有定时装置，所以当有多个微板多次孵育时，对每块微板的孵育计时、分辨就会带来困难。大量的临床试验验证其是具有大热容量而可靠性的孵育方式，仍然是目前我国临床进行ELISA手工试验最常用的孵育方式。
为了更好的标准化孵育温度和时间，科研工作者开始探索和评估用于微生物和细胞培养的干式恒温孵育箱应用于ELISA试验的孵育，这种孵育方式通过加热到设定温度的空气作为导热介质对微板进行孵育称为“空气浴”。如奥地利的Labexim Products公司的TS (Thermostar) 孵育震荡器就是结合了恒温箱和震荡器的功能，缩小了体积用于微板的孵育，升温速度达9℃/分钟；其能够对孵育和震荡实现定时功能。基于干式恒温孵育箱的原理，采用微电脑控制和半导体制冷技术开发的干式恒温孵育器，不同于干式恒温孵育箱完全依赖于空气导热，干式恒温孵育采用金属块(如高纯度铝材等)导热故其也可称为“金属浴”。这种“金属浴”的孵育方式，由于微板底部能够和导热金属块直接接触，使微板上每个孔的孵育温度比“空气浴”更均一。
为了自动化发展的需要，以瑞士Hamilton公司为代表基于干式孵育器的原理开发了一种模块化的塔式孵育器，F.A.M.E.（费米）全自动酶标仪就是是采用这种塔式孵育结构来保障实验的特异性和灵敏度。每块微板孵育在独立封闭的孵育槽中，可同时上下加温减少蒸发。孵育塔中的每一个孵育槽均具备独立的光学和温度传感器、独立的加热元件、独立的加热曲线设定（图40）、独立的避光控制、独立的控温精度与温度范围设定。通过设置室温以及控温孵育温度的上下限，可以实时监控每个孵育槽的温度，如果温度超出设置范围，系统即自动终止此微板的实验，并给出追踪报告。
图40 F.A.M.E.（费米）孵育器加热曲线（Hamilton公司，瑞士）
快速加热曲线
● 适合孵育时间小于30分钟的试验
● 模拟水浴箱加热特性，保证有效孵育时间
中速加热曲线
● 优化升温时间占30%
● 适合孵育时间在30-60分钟之间的试验
慢速加热曲线
● 优化升温时间占30%
● 适合孵育时间在60分钟以上的试验
● 精确加热曲线控制，保证加热缓慢平稳上升，保证抗原抗体牢固结合，提高实验灵敏度
除了上述提到的主流孵育发展之外，也有科研工作者研究了其他方式的孵育。上世纪90年代，很多学者发文报道用微波孵育的方法替代37℃水浴孵育，从而发现酶促反应时间比常规方法缩短近８倍，提示微波对大分子生物活性复合物有明显的生物学效应[20]。微波孵育的原理是通过增加分子免疫复合物能量达到稳定扩散状态。
4. 读数仪
读数仪的发展经历了由手动转为自动、从单孔读数发展为多孔读数的阶段，工作效率不断提高。最初，美国Brinkman公司生产的Organo微板读数仪，需要手持带有光纤的读数探头，逐一放置到每个孔中，光线反馈至光电管中显示为数字进行读数。美国Beckman公司的DU-8微板分析仪则需要与其DU-8 UV/VIS分光光度仪配合使用，使用单波长或者双波长对微板进行分析。
美国Gilford公司推出的封闭的自动化酶免系统，将整个酶免分析过程进行整合。该系统是将不同的TORCH抗原预包被在10孔试管条来完成抗体的检测。洗板是通过蠕动泵进行。读数仪是为10孔试管条专用设计的。
之后出现的美国Dynatech公司生产的MicroELISA Mini Reader MR 590及美国Bio-Tek公司的 ELISA Reader Model 307都是采用手动进板的方式，通过单个读数探头逐一对每个微孔进行读数。MicroELISA MiniReader MR 590主要适用于U底或平底微板。
为了提高读数及分析效率，读数仪逐步向自动化方向发展。美国Dynatech公司生产的MR 600读数仪实现了自动进板及定位，采用双波长检测微板的吸光度值。该设备可以在一分钟内读取一块96孔微板。芬兰EFLAB OY&美国Flow公司推出的Titertek Multiskan读数仪采用一次同时读取8孔信息的方式将读板时间缩短到一分钟，与之类似的美国Litton Bionetics的 Bionetics Autoreader LBI-321同样可以单次同时读取8个孔，但此读数仪可与Litton Bionetics公司的Bio-Enza-Bead系统配合使用检测TORCH抗原抗体及其他抗体，并引入磁转移装置中自动清洗微球颗粒技术。美国Artek Systems Corporation 公司生产的Artek Model 210 Reader通过预编程的方式，全自动进板定位，实现了45秒内完成读数。
1976年，设备生产厂商LabSystem (现在赛默飞世尔科技的一部分）将读数仪发展为Multiskan专用96孔光度计投入市场。这是目前常规读数仪的最早期版本，这一设备开启了我们现在所熟知的酶免读数仪时代。
随着免疫荧光技术的出现，荧光读数仪也随之出现。如早期的FIAX 100 Digital Fluorometer是一款微电脑控制的数字荧光读数仪，将扁棒上的样本插入中心孔中进行读数。数据输送进电脑中进行分析。此系统可与IDT生产的风疹病毒StiQ以及其他病毒抗体系统配合使用。
读标仪从40年前单一的吸光检测到几年前高度复杂的多模式的判读，现在的多功能读数仪已经发展到可进行紫外/可见吸光（UV/Vis Absorbance），发光（Luminescence）等，及其广泛的基于荧光的模式，包括荧光强度（Fluorescence Intensity，FI），荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET），时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence，TRF）及其TR-FRET、荧光偏振（fluorescence Polarization，FP）。德国的BMG LABTECH公司是这种多功能读数仪的代表，其在多功能读数仪发展史上创下了多个第一，如开发了第一台具有FP检测模式的多功能读数仪、第一个将激光技术应用到读数仪的比浊检测中、开发出第一台具有高性能化学发光检测能力的多功能读数仪、第一个将紫外/可见光吸收模式整合到多功能读数仪上等。CLARIOstar多功能读数仪是BMG公司推出的最新一代多功能读数仪。
随着纳米技术微量加样的发展，读数仪将很容易由检测传统的96孔微板，转化为检测384孔微板，甚至1536孔微板，达到更高的检测效率。另一方面，侧重酶免试验处理全过程技术——全自动酶免分析系统，到90年代末已充分发展；随着多任务软件，如OS/2，Unix及Windows NT等操作平台的完善，满足现代实验室GMP/GLP要求的全自动酶免分析系统，正在世界各种实验室普及。
第四章 全自动酶免分析仪的发展
1. 自动化系统的发展
酶免实验室的自动化与标准化，是全面实验室自动化系统（LAS）的一部分。实现酶免试验自动化网络化，是涉及酶免加样（前处理）设备、酶免分析（后处理）设备与医学信息技术、实验室管理科学综合的高技术系统集成，是迈向全面实验室自动化（TLA）的重要基石。
实验室自动化系统是由样本处理与传递技术、开放式实验室仪器和开放式实验室信息系统（LIS）集成而至，并与实验室信息管理系统（LIS）联网。高分析生产力的酶免自动化分析系统，快速发报告意味着快速诊断、快速治疗，将给患者与医院带来双重利益。实验室自动化的目标就是提高检验的质量、增收节支。酶免实验室自动化网络化将给中国新医疗服务体制下的医院酶免实验室带来新的优势与利益。
全自动酶免分析系统在硬件和软件上均符合GMP/GLP规范，具备全过程控制（TPC）系统，可以全自动生成操作日志记录（Traceability）和系统追溯记录（Trackability），这些性能不但有助于建立信息化的质量控制（QC）和质量保障（QA）体系，而且在医疗纠纷举证中，这些记录证据还可以阐明实验操作正确性和可靠性，以及试剂厂商是否应承担试剂质量责任，便于纠纷的处理。所以对酶免自动化的需要不再一味地追求高通量、高速度，而是越来越重视酶免自动化设备在质量控制和全过程溯源等方面的性能。
酶免试验全过程自动化的意义，并非仅仅限于降低劳动强度、减少人为的误差。根据已发表的费米全自动酶标仪评价研究报告，人们发现：全自动酶免分析系统可以普遍地、显著地提高酶免试验的特异性。如费米系统可以提高乙肝表抗的特异性由常规设备的87%到91%，丙肝抗体由常规设备的89.1%提高到97.4%。此外，多中心的评价实验证明，费米全自动酶标仪也可以显著地提高国产试剂的灵敏度，如费米系统可以将乙肝表抗的灵敏度由常规设备的92%提高到93%，丙肝抗体的灵敏度由常规设备的93.7%提高到98.7%[21][22][23]。
第一代全自动酶免分析系统基本特征是单/双针加样系统与微板处理系统一体化，多数孵育位置少于4块板。由于加样本将占用较长时间（单针每微板需15分钟，三块微板通常需45分钟完成加样本工作），因此，第一代全自动酶免分析系统，被认为是“节约劳动力而不提高效率”。
第二代全自动酶免分析系统的基本技术特征为单一任务和单一轨道。由于不能同时处理两种过程（如洗板的同时，不能加试剂等），因此其工作任务表（或时间管理器TMS）“堵车”现象仍无法避免，而造成处理过程不能严格执行，试验完成时间延长，或单纯执行试验时间表完成实验动作而不论试验效率。
第三代全自动酶免分析系统的基本特征是采用多任务、多通道，完全实现平行过程处理。典型产品为瑞士Hamilton公司的F.A.M.E.（费米）全自动酶标仪。费米系统独特品质表现在：硬件上采用了综合模块化设计，广泛采用液体水平检测（LLD）技术、体积与重量传感、光学位置传感等实现了真正全过程控制（TPC），特别是ZL的洗板液体传感器，确保了最佳洗板效果，是保障试验特异性的关键。在软件与功能上，目前仍是唯一的全自动GMP/GLP规范符合系统，如全面的系统跟踪记录（Traceability）与系统追溯（Trackability），标本/试剂加样校验（Sample verification）及“自由任务管理”实现随时增加检测板。1997年费米获得美国FDA许可，用于血站筛查实验室，是第一个获得特许的全自动酶免分析系统，其不含样本加样装置，通常也俗称“后处理系统”。
表7 20世纪90年代主要全自动酶免分析系统特点（大/中型）
表8 20世纪90年代主要全自动酶免分析系统特点（中/小型）
1996年，烟台澳斯邦生物工程有限公司在河北省血液中心成功安装国内第一台费米全自动酶标仪，改写了当时的血液筛查试验技术，提高了血液检测质量，成为酶免实验室的主导设备，中国的安全输血事业由此进入新的里程碑。进入21世纪，以深圳市爱康电子有限公司（2013年更名为深圳市爱康生物科技有限公司）为代表的国内医疗器械公司相继成立，通过与德国、瑞士等国外合作厂商交流、研发生产微板分析自动化检验设备。2005年第一台国产全自动酶免仪URANUS AE诞生。
表9 目前国产酶免分析自动化仪器特点
2. 微板及自动化系统未来趋势
早在2011年，美国医学界首次提出了“精准医学”的概念。直到2015年，美国总统奥巴马在其国情咨文中首次详细的提出了精准医疗计划（Precision Medicine Initiative， PMI），率先揭开了新医疗模式的面纱，使“精准医疗”迅速成为时下医疗行业最炙手可热的话题和出现频率最高的热词。奥巴马在报告中说 “要在正确的时间，给正确的人，正确的治疗。而且要次次如此。” 其本质就是通过基因组、蛋白质组等相关技术，对大样本人群与特定疾病类型进行生物标志物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确诊断出疾病的原因并确定治疗的靶点。在“精准医疗”模式下，目前的诊断技术需要对疾病不同的状态和过程进行精确的分类。而对于基于抗原-抗体（蛋白）相互作用的酶免技术，如果要在“精准医疗”中发挥关键作用，就应该如前边提到需要“更细致、更大量的蛋白数据”。故打破传统的“cocktails-ELISA”束缚，建立基于病原体生活史的“多矢量单蛋白谱分析”是酶免分析实现“大量蛋白数据”的发展趋势。“多矢量单蛋白谱分析”基于病原体的生活史先择多矢量（蛋白标志物）进行检测，以描绘出疾病的整个过程；该技术平台通过采用更高孔密度的微板（如384和1536孔-微板）和微量化实现了酶免分析技术的高通量、高分辨、高内涵。
“多矢量单蛋白谱分析”为酶免分析在“精准医疗”新医疗模式下的应用开启了非常明朗的前景，但这也为微板及其自动化的发展提出了新的挑战。1）目前市场上酶免自动化系统多是基于96孔-微板，导至针对除96孔-微板在液体处理及其洗板的自动化等方面实现的困难，是限制“多矢量单蛋白谱分析”发展实现实验室自动化的主要瓶颈。基于更高孔密度微板的自动化处理系统应该是酶免自动化未来发展的主要方向，加之目前全新的“绝对自动化”真正实现全实验室完整流程操作的无人工干预的自动化模式，也是提高酶免分析技术在新医疗模式下作用的重要前提；2）高通量、高内涵、高分辨的发展趋势，势必产生大数据。大数据对数据分析和管理提出了新的要求,目前自动化系统采集、传输、存储、分析等方面的能力将受到严重的挑战。云端大数据分析基于终端采集数据，在服务器通过无线互联网对检测样本的数据信息做可视化分析、预测性分析、数据质量监控和管理等以发掘出大数据价值。可以预见，未来“多矢量单蛋白谱分析”的数据通过与个体病史信息，体症指标的迅速组合，及自动分析，将提供给临床医师更全面的诊疗方案建议；3）线上到线下（O2O）互联网管理化，向用户提供远程服务：随着互联网商业模式的快速发展，通过3G/4G无线网络技术、无线定位技术、近场无线通信识别（Near Field Communication，NFC）等技术，酶免自动化设备可通过云服务器，实时掌握仪器运行状态、故障报警、试剂使用量监测、测试结果异常等信息，在第一时间对设备故障进行反应，实现远程维护、远程故障处理，提高售后维护效率，降低维护成本。
疾病诊断是“精准医疗”得以实现关键，基于“高通量、高内涵、高分辨”概念的新一代酶免分析技术和自动化平台将成为微板及其酶免分析技术自动化未来发展的方向， 同时也符合“精准医疗”的主流趋势。
