双歧杆菌核酸检测试剂盒

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双歧杆菌核酸检测试剂盒

2019.3.05

双歧杆菌核酸检测试剂盒

本试剂盒选取一对双歧杆菌(BD)特异性引物和一条特异性荧光探针，应用碱裂解法提取DNA，后者在耐热DNA聚合酶(Taq酶)作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR-荧光探针体外扩增法对双歧杆菌(BD)DNA进行扩增，从而达到快速定量检测之目的。

标本采集、保存和运输：
适用标本类型：食道、食品及乳制品(如乳酪、酸奶)及培养菌等样本。
标本采集：
食道内容物：取疑似动物或人食道(胃、十二指肠、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠等)内食物残渣或粪便组织约100-200mg组织，转至一盛有1ml生理盐水的离心管中，密闭送检。
乳制品：取疑似乳制品1g(或1ml)，转至一盛有1ml生理盐水的离心管中，密闭送检。
3. 保存和运输：上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰。

使用方法
1．DNA提取
1.1食道内容物：充分混匀上述标本，将其转至一洁净的1.5ml 离心管中，13,000rpm离心1分钟，弃上清，加入1ml生理盐水，充分震荡，13,000rpm离心1分钟，弃上清，沉淀加250μl核酸提取液B 充分混匀（提取液用前需室温溶解并充分混匀）后100℃10分钟， 13,000rpm离心3分钟，取上清液250μl转至一洁净的1.5ml离心管中，加750μl无水乙醇，充分混匀，13,000rpm离心5分钟，尽量丢弃上清，空气中干燥5-10分钟，待乙醇挥发干净后加50μl阴性质控品溶液沉淀，后取4μl做PCR反应。
1.2 培养菌：直接取100μl菌液，转移至1.5ml离心管中，13,000rpm离心5分钟；去上清，沉淀中加入50μl DNA核酸提取液B充分混匀。100℃恒温处理10分钟；13,000 rpm离心3分钟，取上清液4ul做PCR反应。
阴性质控品：取50μl阴性质控品，加50μl核酸提取液B充分混匀(提取液用前需室温溶解并充分混匀)后100℃10分钟，13,000rpm离心3分钟，取上清液4μl做PCR反应。
BD阳性质控品：直接取4μl进行PCR扩增，或按照PCR扩增介绍方法进行定量分析。
2．PCR扩增
从试剂盒中取出BD-PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂 BD-PCR MIX Taq酶系
用量 24μl 2μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入26μl，向每管中加入处理后样品或BD-阳性定量标准品(使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍，记为1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性定量标准品以及未知标本，并设置反应体积(30μl)、样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件:
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件：94℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40个循环。
LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件：94℃→2分钟，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40个循环。
3．结果分析判定
反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的标准曲线达到zui佳（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty-Copies/ml）。