一、样品的 2DPAGE 和电印迹1.将细胞或蛋白质样品悬浮于变性缓冲液中，至浓度为 3 mg/ml，室温孵育 2 h。 2.必要时，室温条件下用 3 mmol/LTBP(以 20 mmol/L 的储存液稀释至工作浓度）还原蛋白质样品 2 h。 3.加入碘乙酰胺使蛋白质烷基化，室温条件下避光孵育 lh。 4.4°C 条件下，21000 g 离心 5 min。 5.取 115W 上清液，加到 7 cm 的 IPG 胶条上，室温条件下水化 4 h。 6.依照第 4 章方案 5(方法 A) 的步骤，进行等电聚焦（第一向分离）。整个电泳分离过程需要 36000V?h。 7.在等电聚焦平衡缓冲液中平衡胶条 20 min。 8.依照第 4 章方案 7 配制第二向 SEiS-PAGE 电泳胶。 9.依照第 4 章方案 8 的步骤处理蛋白质样品，以备第二向的 SDS-PAGE 分离。 10.将 IPG 胶条加到 4%~12% 的微型 SDS-PAGE 凝胶的顶部，依照第 4 章方案 9 进行第二向电泳。 11.依照第 4 章的方案 15 或方案 16 的步骤，电泳后以 400mA 转移 1.3 h，将蛋白质从胶上转移至 Immobilon-Psq 膜上。 12.用直接蓝-71 染色（见 Hong，etal，2000)。 13.真空干燥，然后将膜保存于密封的塑料袋中以防角蛋白污染。 二、化学打印膜的制备14.用导电胶带（3M) 将干燥的膜粘到 MALDI 板上。 15.用离线扫描仪采集已粘到 MALDI 板上的转膜蛋白的图谱。 16.利用局部分割图像分析算法自动或用「pointandclick」方法手动检测图像上的蛋白点。 该质谱仪（ShimadzuBiotech) 带有相应的软件。 17.为在化学印刷仪上标记 MALDI 膜的相对位置，如图 8.48 选择 3 个点进行标记，用数码相机 XY 坐标定位蛋白，计算其精确位置。 三、蛋白质点的膜上自动酶解18.编辑化学打印仪的程序，使之向膜表面自动喷洒 1%(体积分数）OGP，每个蛋白点约 1.5nl(15 滴），重复三次（总体积相当于 4.5nl)。 使用非离子去垢剂 OGP 可以确保 PVDF 膜表面的湿润，也可以作为封闭剂减少 PVDF 膜对蛋白质内切酶的吸附。 编辑化学打印仪的程序，喷洒 1nl(10 滴）200ng/ul 的膜酶（溶于 25 mmol/LNH4 HCO3) 到已覆盖 OGP 的膜表面，重复 50 次（终体积为 50nl)。如此，每个蛋白点上约有 10 ng 胰酶。 对于需以喷洒两种蛋白内切酶的同一蛋白点采集 PMF 数据的实验，则应喷洒 lg/L 聚乙烯吡咯烷酮/50%(体积分数）甲醇，每次 60 滴。 19.将印刷完毕的膜放人湿盒中，37°C 孵育 3 h。 20.酶解后，将膜重新放人化学打印仪。 21.向基质溶液中加入 50fmoles/ul ACTH。 四、MALDI-TOF-MS 分析22.将 PVDF 膜（粘在 MALDI 板上）放人质谱仪中，然后利用 Axima-CFR 的软件 AScii2plate，将与喷涂位置相对应的坐标数据转换为 Axima-CFR 的平台定位文件 [见图 8.49(a)，（b)]。
 23.以正离子模式采集质量图谱。多肽离子化所用光源为 337nm 的氮激光，时间延迟提取脉冲加速电压为 25kV。 对于在某一位置内所采集的所有图谱来说，膜表面平整与否对其质量没有影响 [见图 8.49(C)]。 24.对样品的激光平均轰击次数为 50~100 次。以胰酶自酶解片段（单同位素质量为 842.51Da) 和 ACTH 肽（单同位素质量为 2465.19Da) 为标准，进行两点内标校正。 25.利用峰采集程序（Breen，etal，2000) 采集单同位素峰数据，使用 PMF 搜索引擎（该引擎搜索GenBank,www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) 或 ExPASyPeptIdent(www.expasy.ch) 来鉴定蛋白质。
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