认识荧光显微镜的光立方

2020.2.22

什么是荧光?

荧光即为物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，进入激发态, 发射出的长波光。

无论是物质的自发荧光、荧光染料还是融合表达的荧光蛋白，均需经过特定波长的光激发(激发光Excitation)，电子发生迁移后，能量损失后，发出特定长波长的光(发射光Emision)，可通过检测系统采集，达到识别特定荧光的作用。

特定荧光的作用

什么是荧光光立方?

在荧光显微镜观察和成像中，通过荧光光立方提供特定波长的激发光和对应的长波长发射光，从而通过肉眼、显示屏或相机采集荧光信号，因此，荧光光立方是决定可以检测到何种荧光信号的关键器件，其特性包含EX：激发波长滤光片参数，EM：发射波长滤光片参数和DM：二分镜参数。以Revolve正倒置一体荧光显微镜的DAPI光立方为例，EX：385/30，EM：450/50，DM：425。

光源发出的光经过DAPI EX，得到特定波长范围的激发光，即得到385±15nm的光，特异性地激发在此范围内才能被激发的荧光物质;DM二分镜是将激发光与荧光分离的光学元件，作为特殊的反射镜，只反射特定波长的光，允许所有其它波长通过，因此只有>425nm的光能被传输到EM;EM发射滤光片是将荧光基团发出的荧光与其它背景光分离开来的光学元件。发射滤光片通过二向色镜传输荧光波长的光，同时阻挡从激发光源(从样品或光学元件反射)泄漏的所有其它光。发射光波长大于EM才能被观察到，即只有450±25nm范围内的光进入检测系统。选择适当的EX，EM滤光片和DM二分镜能够帮助研究人员获得更高的信噪比(S / N)。

Excitation filter (EX)——激发滤光片工作示意：

激发滤光片工作示意