文章导读

　　2020年3月20日，云序客户上海交通大学附属第一人民医院田聆教授课题组在高分期刊Moleular Cancer杂志（影响因子10.679）发表了关于外泌体在胰腺癌肿瘤再生长中的研究。肿瘤再生长是放射治疗失败的主要原因。以往的研究表明，死亡的肿瘤细胞通过促进残留的肿瘤再生细胞(TrCs)的增殖，在肿瘤再增殖过程中起着至关重要的作用。然而，TRCs在放疗后也会遭受DNA损伤，并可能在垂死细胞释放的增殖因子的刺激下发生有丝分裂错误。因此，本研究打算找出这些自相矛盾的生物学过程是如何发生的，以降低放疗后肿瘤的再增殖可能。接下来，小编就带大家一起解读这篇高分文章。

　　发表期刊：Mol. Cancer

　　影响因子：10.679

　　发表日期：20200320

　　实验方法：全转录组测序、外泌体miRNA测序（云序提供测序服务）

　　文献链接：Dying tumor cell-derived exosomal miR-194-5p potentiates survival and repopulation of tumor repopulating cells upon radiotherapy in pancreatic cancer

　　 文章内容

　　（1）受辐射的垂死肿瘤细胞释放的外泌体可动态增强肿瘤的繁殖

　　首先作者通过相关研究证明受辐射的垂死肿瘤细胞分泌的外泌体在辐射后期会促进增殖。为了弄清原理，作者对辐射前后的胰腺癌细胞进行了全转录组测序（本实验云序提供）。并进行了GO分析，发现差异基因多富集在与细胞外囊泡和外泌体调控有关的条目中（图1a）。接着作者进一步研究发现，与未辐照的胰腺癌细胞相比，辐照过的胰腺癌细胞的外泌体释放量增加（图1b）。为了验证外泌体在存活的肿瘤细胞中的直接作用，作者在体外进行了菌落形成试验。放射后，用垂死的肿瘤细胞来源的外泌体处理的癌细胞的集落形成能力显着增强（图1g）。结果表明，来自垂死的肿瘤细胞的外泌体可以促进放射后的细胞存活。

　　作者进一步探讨了外泌体对胰腺癌的作用，作者在胰腺癌异种移植（PDX）小鼠模型中进行了体内实验。发现辐照的PDX肿瘤能加速种群重现（图1h）。当PDX小鼠同时用GW4869（外泌体抑制剂）治疗时，肿瘤的种群显着减慢（图1h），小鼠的生存时间延长了（图1i）。这些结果表明，垂死的肿瘤细胞来源的外泌体促进了肿瘤的重新聚集。

　　图1：受辐射的垂死肿瘤细胞释放的外泌体可以动态增强肿瘤的繁殖

　　（2）垂死的肿瘤细胞释放的外泌体增强了ALDH1A1+ TRC的存活

　　作者认为肿瘤再生细胞（TRC）可能是外泌体的主要受体。由于目前没有办法鉴定TRC，因此作者收集了放射后存活的胰腺癌细胞，并通过高通量测序分析了癌症干细胞相关基因的表达谱。发现与未辐射的对照组相比，有62个基因表达被上调， 值得注意的是，辐射后ALDH1A1的表达显着上调（图2a）。众所周知，ALDH1A1是胰腺癌干样细胞重要的标志物之一。ALDEFLOUR™实验表明，放射后存活的癌细胞和原发性胰腺肿瘤细胞中ALDH +细胞的比例显着提高（图2b-c）。qPCR分析和Western印迹表明，ALDH1A1的表达在受辐照的胰腺癌细胞和PDX肿瘤组织中表达上调（图2d）。免疫组织化学（IHC）染色进一步显示，ALDH1A1+细胞在PDX肿瘤组织中照射后高度富集（图2e）。但是，GW4869显著抑制了ALDH1A1+细胞的积累（图2e），这表明外泌体可能会促进ALDH1A1 +细胞的存活。

　　此外，作者检查了垂死的肿瘤细胞对TRC的直接保护作用。当与受辐照的胰腺癌细胞共培养后，受辐照的细胞表现出明显更高的存活率（图2g-h）。如图所示，辐射细胞分离的外泌体显著提高了细胞的存活率（图2h）。以上结果表明，在放疗中垂死肿瘤细胞分泌的外泌体能提高ALDH1A1+ TRC的存活率。

　　图2：垂死的肿瘤细胞释放外泌体增强了ALDH1A1 + TRC的存活

　　（3）外泌体通过促进DNA损伤反应增强TRC的存活

　　接着，作者探讨了垂死的肿瘤细胞分泌的外泌体如何促进ALDH1A1+细胞的存活。H＆E染色显示，PDX肿瘤中的细胞在放射后14天呈现出较大的核，并具有明显的异质性（图3a），这表明了放射损伤的积累。辐射后50天，细胞恢复了活力，并恢复了“正常”的细胞核形态。但是，GW4869处理后阻碍了肿瘤细胞的恢复（图3a）。值得注意的是，ALDH1A1+和γH2A.X双重染色表明，辐射后，ALDH1A1+细胞也遭受了DNA损伤（图3b）。在GW4869治疗组中，大多数ALDH1A1+细胞在放射后50天仍显示出明显的γH2A.X阳性灶（图3b）。这些数据表明，辐射后TRC的存活涉及DNA损伤反应（DDR），该损伤由受辐射的垂死肿瘤细胞的外泌体调节。

　　此外，作者还探究了外泌体是否能直接促进体外辐射存活TRC的DDR。如示踪细胞所示，辐射在ALDH1A1+和ALDH1A1-细胞中均引起DNA损伤（图3c）。GW4869显著损害了ALDH1A1+细胞的修复，因为它们中的大多数在放射后3天仍携带γH2A.X阳性灶（图3c）。此外，来自辐射的垂死肿瘤细胞的外泌体显著加速了γ-H2A.X和pATM的衰减（图3d）并降低了辐射细胞中DNA损伤（图3e）。总体而言，这些结果表明，受辐射的垂死的肿瘤细胞来源的外泌体通过促进DDR增强了TRC的存活。

　　图3：外泌体通过促进DDR增强TRC的存活

　　（4）外泌体miR-194-5p促进受损TRC的修复

　　作为外泌体的重要内含物，作者推断miRNAs可能在TRC的存活中起重要作用。因此，作者进行了对辐射前后的肿瘤细胞外泌体进行了外泌体miRNA测序（本实验云序提供），发现在垂死的肿瘤细胞来源的外泌体中，两个重要的miRNA，即miR-196b-5p和miR 194-5p显着上调（图4a）。前人研究表明，miR-194可能参与基因组稳定性。因此，作者将其作为目标分子，通过qPCR分析验证了miR-194-5p在外泌体中的高表达（图4b）。同样，miR-194-5p mimics转染的细胞在辐射后具有更强大的集落形成能力（图4d）。此外，当使用强力霉素处理时，胰腺癌细胞的集落形成被显著抑制。但是，如果强力霉素诱导后的胰腺癌细胞暴露于辐射中，则这些细胞的集落形成将显著增强（图4e）。此外，miR-194-5p mimics在辐射的胰腺癌细胞中显著促进了γH2A.X和pATM的衰减（图4f）和DNA损伤的减少。这些结果表明，外泌体miR-194-5p通过促进DDR促进了TRC的存活。

　　为了进一步确定miR-194-5p的主要有效靶标，作者首先预测了它的靶基因，并对预测结果进行KEGG分析，预测目标中只有转录因子E2F3与细胞周期调控有关。E2F3是E2F家族的一员，已被广泛发现可促进癌症的发生和发展。于是作者用双重荧光素酶报告基因检测证明E2F3是miR-194-5p的直接靶标（图4g）。与miR-194-5p相反，E2F3过表达促进细胞周期进程和EdU掺入，并阻碍pATM和γH2A.X的衰减（图4h）并减少受辐照的胰腺癌细胞中DNA的损伤。E2F3基因敲除提高了放射后胰腺癌细胞的集落形成能力，而miR-194-5p mimics的转染并没有进一步增强该能力（图4i）。这些数据表明外泌体miR-194-5p抑制E2F3诱导G1 / S阻滞并促进DNA损伤修复。

　　先前的研究确定HMGA2和E2F3是胰腺癌的八个主要调节枢纽中的两个， 作者发现HMGA2负调控miR-194-5p的表达（图4j），并通过一系列实验证明，HMGA2富含茎状ALDH1A1+细胞，并且有助于胰腺癌的进展。但是，当胰腺癌细胞暴露于10Gy辐射时，HMGA2的过表达显著抑制了这些细胞的集落形成能力（图4k），而敲除HMGA2则增强了细胞存活和集落形成（图4l）。HMGA2还阻碍了辐射的胰腺癌细胞中pATM和γH2A.X的衰减（图4m）和DNA损伤。总之，这些数据表明，TRC中富集的HMGA2促进了干细胞的生长和癌症进展，但潜在地损害了辐射的TRC的存活和恢复，而来自垂死的肿瘤细胞的外泌体miR-194-5p瞬时逆转了辐射下HMGA2的作用。

　　图4：外泌体miR-194-5p促进受损TRC的修复

　　（5）垂死的肿瘤细胞释放的PGE2促进TRC的增殖

　　如前所述，垂死的肿瘤细胞能促进报告细胞的增殖，这暗示着TRCs被除了外泌体miR-194以外的物质驱使加速了增殖。众所周知，受辐射的垂死肿瘤细胞还释放了PGE2，这是一种脂质代谢产物，被认为是化学放疗后肿瘤重生的重要介质。因此，作者通过ELISA定量了受辐射的垂死胰腺癌细胞中的PGE2，发现放射后24小时PGE2含量保持不变，但在48小时略有升高，而在72小时显著增加（图5a）。

　　同样，PGE2形成的关键酶PTGS2（COX-2）的表达也经历了短暂的滞后阶段，之后逐渐增加（图5b-c）。而辐射后，胰腺癌细胞中，外泌体相关蛋白（如RAB27A，TSG101和CD9）的表达立即增加（图5c）。值得注意的是，当COX-2的表达逐渐增加时，外泌体相关蛋白的表达减少（图5c）。在PDX小鼠模型中，IHC染色还显示，放射后不久，外泌体相关蛋白的表达升高，直到12天后下降，此时COX 2的表达开始显著上调（图5d）。

　　同时，发现 celecoxib（一种抑制PGE2合成的COX-2抑制剂）以剂量依赖性方式显著抑制了肿瘤细胞的繁殖（图5e）。虽然PGE2可以加速肿瘤细胞的增殖，但是在放射后立即向肿瘤细胞中添加PGE2会反向抑制细胞活力（图5f）。值得注意的是，celecoxib处理并不会影响外泌体相关标志蛋白质的表达（图5g）。这些结果表明，辐射的垂死肿瘤细胞分泌的外泌体对于肿瘤的再形成至关重要。

　　综上，这些结果表明，垂死的肿瘤细胞释放的外泌体和PGE2共同作用导致了肿瘤的再增殖级联反应，其中外泌体miR-194-5p首先抑制细胞增殖以促进TRC的恢复，然后PGE2促进TRC的加速增殖。

　　图5：垂死的肿瘤细胞释放的PGE2促进回收的TRC的增殖

　　（6）阿司匹林通过削弱垂死的肿瘤细胞的分泌物来抑制放疗后的肿瘤

　　作者前期研究推测，阿司匹林可能具有抑制胰腺癌中肿瘤再增殖的潜力，前人研究也表名其会影响外泌体和miRNA。因此，作者首先在体外测试了阿司匹林治疗在肿瘤细胞重塑模型中的作用。发现阿司匹林极大地抑制了与辐射的垂死肿瘤细胞共培养的报告细胞的增殖（图6a），而当它们单独培养时对报告细胞的增殖没有影响。阿司匹林降低了辐射的胰腺癌细胞上清液中的PGE2含量（图6b），并减少了细胞释放的外泌体的量（图6c）。此外，在阿司匹林处理过的辐射细胞衍生的外泌体中，miR-194-5p被下调（图6d）。与仅接受放射线处理的细胞分泌的外泌体相比，经阿司匹林处理的辐射细胞衍生的外泌体丧失了诱导G1 / S阻滞并减少EdU掺入的能力（图6e-f）。因此，经阿司匹林处理的辐射细胞产生的外泌体在辐射后不能促进胰腺癌细胞的集落形成（图6g）。

　　接着，作者又在PDX小鼠模型中测试了阿司匹林治疗的效果。阿司匹林单一疗法对PDX肿瘤无治疗作用，单独放疗同样无治疗作用（图6h-i）。然而，阿司匹林治疗和放射疗法的结合显著抑制了肿瘤的重新聚集并延长了荷瘤小鼠的存活时间（图6h-i）。此外，阿司匹林损害了放疗后肿瘤组织的恢复，这与GW4869的作用相似。同时，阿司匹林还抑制了放疗后肿瘤组织中ALDH1A1+ TRC的富集。这些数据表明，阿司匹林可抑制胰腺癌放疗后的肿瘤再增殖。

　　图6：阿司匹林通过削弱垂死的肿瘤细胞的分泌物来抑制放疗后的肿瘤

　　总结

　　总的来说，本研究通过全转录组测序（云序提供）和外泌体miRNA测序（云序提供），鉴定显著变化的miRNAs。并采用qPCR、Western blot、IHC、FACS、集落形成等实验进行分子和细胞分析，发现垂死肿瘤细胞来源的外泌体通过传递miR-194-5p诱导G1/S期阻滞，促进DNA损伤反应，提高TRCs的存活率，进而调节E2F3的表达。此外，外泌体miR-194-5P可减轻放疗时致癌HMGA2的毒副作用。在潜伏一段时间后，垂死的肿瘤细胞进一步释放大量的PGE2来恢复TRCs的增殖，并协调了再增殖的级联反应。值得注意的是，该研究发现小剂量阿司匹林可以通过抑制外泌体和PGE2的分泌来抑制胰腺癌放疗后的再生长。

　　图7：阿司匹林破坏垂死肿瘤细胞分泌的外泌体导致的肿瘤再生级联反应

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