关注公众号

关注公众号

手机扫码查看

手机查看

喜欢作者

打赏方式

微信支付微信支付
支付宝支付支付宝支付
×

戊二醛固定剂的功能及作用特点

2023.2.11

戊二醛是一种五碳醛,含有两个醛基。分子式为$C_5H_8O_2$,分子量为100。电镜固定通常用市售的25%的戊二醛水溶液稀释成需要的浓度。其pH为4.0$\sim$5.0。氧气、高温、中性或碱性pH均能使戊二醛发生聚合失去醛基,并降低交联效力,所以平时这种原液应保存在低温处。此外戊二醛存放时间过长时,pH值会降低,颜色变黄,固定效力也大大降低,若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其它杂质时,必须纯化后才能使用。戊二醛对皮肤有硬化作用,但它的挥发性较甲醛弱,最好能在通风橱中操作。

戊二醛作为固定剂有如下特点:

它的反应速度快,是优良的前固定剂。但它的渗透速度较慢,必要时配合甲醛使用效果更佳。

它是蛋白质的强固定剂。它能快速而不可逆地与氨基反应,和甲醛相似,戊二醛的一个醛基与氨基反应,脱水后生成不稳定的Schiff键化合物。

由于戊二醛有两个醛基,它可以通过与相邻的另一氨基反应,而产生交联作用。戊二醛的两个醛基也可能与同一氨基作用,形成环状结构

这种环状结构可以进一步与另一戊二醛反应,生成丁间醇醛冷凝物(Aldol condensate)。这种化合物与氧分子共同作用,生成稳定的嘧啶类衍生物(Pyridine derivatives),并在此过程中发生交联。

固定剂

与甲醛不同,戊二醛的这一步反应是不可逆的,而且需要氧气的参与。由于大块的样品内部氧气供应不足,戊二醛在大块样品的内部无法形成稳定的生成物,会导致样品内部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定时,小块的样品固定效果较为理想。戊二醛通过交联作用固定蛋白质的过程会伴随氢离子的释放,使样品pH值降低。为了维持pH值稳定在最佳水平,在戊二醛的固定剂中要加入足量的缓冲液。

戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA,能保存糖原,也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提,因而对细胞膜的固定效果不理想。

戊二醛在固定过程中并不完全破坏细胞膜的半透膜特性,因而需要选择合适的固定液渗透压,以免造成固定假象。但合适的固定液渗透压随被固定细胞和缓冲液的种类改变,很难找到一个通用的渗透压。在实际操作中,$1.0\%-2.5\%$戊二醛(使用0.1M磷酸盐缓冲液或0.1M二甲胂酸盐缓冲液)在一般情况下,已经能提供理想的固定效果。除非观察到明显的渗透压造成的假象,一般不对固定液专门进行渗透压调节。

用戊二醛前固定的样品不易变脆,可以进行长时间固定(但最好不要超过一个星期),因而适用于远离实验室或野外现场取材。但戊二醛在稀释溶液中会自行发生一系列反应,因而固定液应尽可能新鲜配制中。


推荐
关闭