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采用MassWorks对青霉素G新的微量代谢产物进行确证

2012.5.02

　　浙江大学用户与台湾中兴大学再次合作，在Rapid Commun. Mass Spectrom上发表文章《 Identification of new minor metabolites of penicillin G in human serum by multiple-stage tandem mass spectrometry》，采用MassWorks在四极杆质谱上测定了青霉素G的8种新代谢产物的精确质量数，并对血浆中微量代谢物进行了确证。

多级质谱确证人血清中青霉素G新的微量代谢产物

Hsin-Pin Ho1, Ren-Jye Lee1, Chung-Yu Chen1, Soo-Ray Wang2, Zu-Guang Li1,3 and Maw-Rong Lee1*

　　1 Department of Chemistry, National Chung Hsing University, Taichung 40227, Taiwan, R.O.C.

　　2 Department of Interncel Medicine, Chung Shan Medical University and Chung Shan Medical University Hospital,

　　Taichung 40201, Taiwan, R.O.C.

　　3 College of Chemical Engineering and Materials Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014 Zhejiang, P.R. China

　　摘要：液相色谱质谱和液相色谱串联质谱法常被用于药物代谢物的研究。虽然这两种方法已经解决了代谢物鉴定及结构表征的分析，但是仍然是比较耗时的。本文中，一种新的多级串联质谱方法用于人血清中青霉素G的微量代谢产物-一种β-内酰胺抗生素的鉴定及结构表征的分析。青霉素G的七种微量代谢产物包括5种I相代谢产物和2种II相代谢产物通过应用LC-MSn数据分析方法而得到确证。青霉素G的七种代谢产物的精确质量数通过质谱校正软件(MassWorks)得到确证。本文的LC-MSn数据分析方法能够在代谢分析中提供微量代谢产物的丰富的、必要的结构信息。

前言

　　略

实验

化学试剂

　　所有化学试剂均为分析纯，青霉素G(99.7%)购自Riedel-deHae¨n(Sseelze，德国)。青霉素G的代谢产物青霉噻唑盐购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA).色谱级的甲醇、乙腈、甲酸购自Merck(Darmstadt，德国)。用水为经过Milli-Q(大于18.2MΩ，Millipore，法国)净化的超纯水。青霉素G和青霉素噻唑盐储备液(1000 ug/ml)用高纯水制备。青霉素G和青霉素噻唑盐的混合工作液(100 ug/ml)用超纯水稀释到相应的浓度。储备液储存在0℃冰箱中。

体内血清样品的制备

　　略

色谱条件

　　液相色谱分离系统为LC1100(安捷伦科技，Santa Clara，CA,USA)带有二元泵和在线脱气装置。Phenomenex Luna C18柱和C18 预柱用于液相分离，流速为0.2 ml/min。流动相为0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)。进样量5 ul，梯度洗脱程序如下：

时间（min）	0.1%甲酸水（A）	乙腈（B）
0	95	5
1	95	5
27	20	80
41	20	80
42	95	5
50	95	5

质谱条件

　　LTQ-线性离子阱质谱仪(Thermo，San Jose，CA,USA)带ESI离子源。将青霉素G和青霉素噻唑盐以10 ul/min的流速经流动注射泵直接注入ESI源得到质谱调谐条件，流动相为40%A，流速为0.2 ml/min，经T型管路与流动注射连接。优化的离子化及离子传输条件如下：鞘气流速为29arb，辅助气流速为5arb，喷雾电压为正离子模式4kv，毛细管温度为275℃，毛细管电压为41V，透镜电压为125V。在多级串联质谱中，质谱分析的参数如下：分离宽度为3.00Th，碰撞能量为25%，Q为0.25，激活时间为30ms。

数据分析条件

　　为了得到足够的结构信息，同时减少数据采集，设置LTQ的条件如下：(1)执行数据分析的筛查，对代谢产物进行检测;(2)设置选择性数据分析扫描方法;(3)得到母离子和中性丢失离子数据对代谢产物进行确证;(4)解析LC/MSn数据。

　　一个四项扫描设计用于数据分析的扫描。质谱扫描中，第一个扫描事件为全扫模式，扫描范围为148-1000m/z，第二个扫描事件为相关产物离子的MSn扫描，通过动态排除得到高于预设强度的大量的质谱峰。动态排除的参数为：重复3次，重复持续时间为30，排除列表的大小为100，排除持续时间为30。根据初步的数据分析，有针对的数据分析扫描能够得到目标代谢物的更多结构表征信息。

　　经过有针对性的数据分析扫描，在Xcalibur软件中多级质谱的色谱图上可以得到母离子和中性丢失离子的数据。母离子数据通过在MS2上提取特定的碎片离子而得到，中性丢失离子数据也是通过在MS2上提取中性丢失离子而得到。

精确质量数评估

　　开始采集数据前，进一针5ug/ml的包括青霉素G、青霉素噻唑盐、土霉素和玉米黄素的混合校正溶液。得到的轮廓图数据应用MassWorks软件(Serno,Bioscience,Monmouth)对不对称峰形和质量数进行校正。接着进实际样品。同样，LC/MS方法得到的轮廓图数据也应进行峰形和质量数的校正。最后，基于精确质量数和谱图准确度得到所有可能的分子式。

结果讨论

青霉素G和青霉素噻唑盐的碎片

　　略

体内代谢分析

　　略

精确质量数测定

　　单位质量分辨率质谱对定性分析仅提供粗略的质量确证，因此需要精确质量数测定。本文采用MassWorks软件确证检测的代谢产物的分子式。结果如表2所示。质量误差小于25.5mDa。质量精度在96.1%-99.2%范围内。由于外部校正的应用和可能的空间效应对离子阱的影响，目标代谢产物的质量误差仅能控制在50 mDa内。良好的同位素轮廓图校正提供的信息能够对目标物分子式进行确证。

表2 青霉素G及其代谢物的精确质量数

代谢产物	[M+H]⁺分子式	理论质量数（Da）	测定质量数（Da）	质量误差（mDa）	谱图准确度
母体药物	C₁₆H₁₉N₂O₄S	335.1066	335.1187	12.1	98.1
青霉素噻唑盐（M1）	C₁₆H₂₁N₂O₅S	353.1171	353.1342	-17.1	97.8
青霉素吡唑酸盐（M2）	C₁₅H₂₁N₂O₃S	309.1273	309.1121	15.2	96.7
M3	C₁₉H₂₅N₂O₇S	425.1382	425.1459	-7.6	98.1
M4	C₁₉H₂₇N₂O₇S	427.1539	427.1619	-8.0	99.2
M5	C₁₆H₂₁N₂O₆S	369.1120	369.1247	-12.7	97.7
M6	C₂₂H₂₉N₂O₁₁S	529.1492	529.1747	-25.5	98.9
M7	C₂₂H₃₁N₄O₈S₃	575.1304	575.1495	-19.1	96.1