液相色谱及液质联用技术在环境分析中的应用
高效液相色谱(HPLC )是在经典液相色谱的基础引入气相色谱理论加以改进和发展起来。经典的液相色谱是历史最为悠久的色谱技术,气相色谱相比,它却经历了半个世纪坎坷不平的发展道路。20世纪60年代末,经典的液相色谱才发展成高效液相色谱。进入20世纪80、90年代后,高效液相色谱迅速发展,目前已广泛应用于环境监测、生物化学、石油化工等各个领域之中,并且在监测分析大气、水质、土壤、生物和食品
等环境样品方面取得了重要的成果[1]
。
气相色谱主要分析的特点是通常在高温下分析,要求样品必须具有热稳定性、样品必须是挥发性的、流动相只用来带动样品,不参与分离作用、分析样品分子量一般小于500amu 、难于回收。而液相色谱的主要分析的特点是可以在常温下分析、样品必须溶于流动相、固定相与流动相均参与分配作用、分析样品无分子量限制、样品容易回收等。在已知有机化合物中,适用于气相色谱分析的挥发性化合物约占20%左右,而80%左右的化合物均属于挥发性低、易受热分解、离子型化合物或大分子化合物(分子量大于300amu 以上),这些化合物大
部分皆适于高效液相色谱分析。而液相色谱与质谱接口技术的发展,实现了液质联机,进一步提高了液相色谱分析的灵敏度和定性能力,极大地拓展了高效液相色谱的分析能力和领域。当前高效液相色谱在分离速度、柱效、检出灵敏度和自动化等方面都达到了与气相色谱取长补短、互相媲美的程度,两种色谱分析技术在环境监测等领域中起着相辅相成的作用。
1高效液相色谱及液质联用技术在环境分析中的应用
在环境监测中,高效液相色谱及液质联用技术已逐步上升为常用的监测方法。如多环芳烃类、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药、除草剂等[2]。
现行的《地表水环境质量标准》(GB /T3838－2002)中有机污染物特定项目68项
,《生活饮用水卫生标准》(GB5749－2006)毒理指标中有机化合物53项,这些有机物指标大都使用气相色谱及气质技术测定,少数采用高效液相色谱法测定,如多环芳烃、阿特拉津。随着社会发展和环保意识的增强,人们对饮用水质量的关注度越来越高,国家也提高了对饮用水源水质中有毒有害化合物的检测要求。事实上地表水有机污染物指标中有很多组分可开发高效液相色谱及质谱联用法。
下面就从液相色谱适合分析的特点:分子量大、挥发性低、热稳定性差、极性较强等几个方面介绍,结合本实验室实际工作,有针对性的举例说明,HPLC结合质谱技术在环境监测中的具体应用。
1.1多环芳烃类(PAHs)
———具有荧光响应,液相色谱法可获高灵敏度
PAHs是一类由2个或2个以上苯环连接而成的碳氢化合物,包括萘、蒽、菲、芘等150余种,可分为芳香稠环型和芳香非稠环型,许多多环芳烃类具有三致毒性[3]。PAHs的水溶性较差,脂溶性较强,可在生物体内蓄积。
目前气相色谱/质谱[4－5]和液相色谱[6]是检测PAH最常用的方法。气相色谱/质谱具有高选择性、高分辨率的特性,而且由于多环芳烃的热稳定性,用质谱作为检测器时,能够得到大的分子离子峰和很少的碎片离子,所以用GC－MS测定时定性更加准确。相对于气相色谱,液相色谱可以更好地测定低挥发性的多环芳烃,并能够有效分离多环芳烃的同分异构体,采用荧光检测器时,能够获得优于GC－MS的灵敏度。气相色谱质谱测定检出限可达μg/L,而高效液相色谱法测定检出限可达ng/L。我国现行标准HJ478－2009已采用高效液相色谱－紫外检测器－荧光检测器检测水和废水中多环芳烃类污染物。
1.2氨基甲酸酯类农药
———存在热降解问题
氨基甲酸酯类农药是20世纪50年代发展起来的有机合成杀虫剂,是继有机磷农药后发展较为迅速的新型杀虫剂和除草剂。其中甲萘威、呋喃丹为地表水80项指标。氨基甲酸酯类农药部分品种热稳定性差,多数品种紫外吸收和荧光吸收差。鉴于这些特性,该类农药在气相色谱分析及液相色谱分析中均存在一定的问题。
目前应用于氨基甲酸酯农药残留检测的方法分为化学法和生物法两大类。生物法包括活体生物测定法[7]、乙酰胆碱酯酶抑制法[8]、酶联免疫法[9]等,简单快速,易操作,但氨基甲酸酯类农药都具有胆碱酯酶抑制作用,特异性较差,检测的物质和农药品种有限。色谱法多采用高效液相色谱法[10]、液质联用技术[11]或气相色谱[12]、气质联用技术测定[13]。气相色谱法和气质联用技术由于部分氨基甲酸酯类农药的热稳定性较差,采用这两种方法测定会造成分解,如涕灭威,甲萘威等,造成测定不准确,因此液相色谱比气相色谱更适合于氨基甲酸酯类农药的分析。液相色谱柱后衍生荧光法应用最广泛,EPA8318、EPA531等方法均采用液相色谱柱后衍生法测定该类化合物,该法灵敏度最高。而采用液质联用技术无需对其进行衍生化,定性也更加准确,尤其适用于复杂基质的痕量分析。
1.3苯胺类、丙烯酰胺、草甘膦
———极性较强化合物
极性较强化合物不适合气相色谱分析,在毛细管柱上会存在峰形拖尾现象,解决方法可采用衍生化法掩盖极性基团,但衍生化前处理增加了分析步骤,也增加了分析误差。这类化合物只要具有紫外或荧光吸收,就可采用液相色谱法进行分析,若不具备紫外或荧光吸收,可考虑采用质谱检测器进行检测。
苯胺是重要的化学中间体,用途广泛。我国将苯胺类化合物列为环境重点污染物,并制定了最高允许排放浓度。同时在集中式生活饮用水地表水源地标准限值也规定了苯胺为0.1mg/L。标准检验方法:GB/T5750.8－2006《水和废水监测分析》第四版液相色谱法。
丙烯酰胺具有致癌性。《地表水环境质量标准》(GB3838－2002)中规定,集中式生活饮用水地表水源地中丙烯酰胺的标准限值为0.5μg/L。《生活饮用水标准检验方法》(GB/T5750－2006)及《水源水中丙稀酰胺卫生检验标准方法气相色谱法》(GB11936－89)中均采用气相色谱法,该方法要求水样经溴化,乙酸乙酯作为萃取溶剂,电子捕获检测器检测,仅适用于生活饮用水、水源水和比较洁净的地表水中丙烯酰胺的测定,最低检出限为0.05μg/L,该方法的存在问题:样品前处理工作较为复杂、样品经溴化衍生提取后,干扰较多、无法准确定性、峰型拖尾严重。国外的主要分析方法:针对水和废水样品的美国EPA Method8032A:气相色谱－电子捕获检测法、美国EPA Method8316直接进样－高效液相－紫外检测法、德国DIN38413－6高效液相色谱－串联四极杆质谱检测法。
本实验室采用高效液相色谱－串联四极杆质谱检测水体中丙烯酰胺,可直接进样,检出限达ng/L,完全满足国家标准限值要求。标准样品色谱图见图1
。
图1丙烯酰胺标准品色谱图(0.4μg/L)
Fig.1LC/MS/MS chromatogram of acrylamide(0.4μg/L)
草甘膦(Glyphosate,PMG)是当今世界上产量最大的除草剂,是除草活性最强的有机磷农药,能控制危害最大的杂草中的76种,应用十分广泛。长期大量使用,已对环境造成影响,因此《生活饮用水卫生规范》(GB/T5750.9－2006)中规定其限量为0.7mg/L。
一方面,草甘膦具有强极性、低挥发性的特点,导致其难以气化,且在常规反相柱上没有保留,难以利用气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)进行分离测定;另一方面,由于缺少生色基团,难以直接利用紫外和荧光检测器进行检测
。
图2500μg/L草甘磷衍生化反应后高效液相色谱图
(保留时间6.19min)
Fig.2HPLC chromatogram of Glyphosate derivative
(500μg/L,tＲ=6.19min)
本实验室采用芴代甲氧基酰氯(FMOC )衍生化试剂对草甘膦进行柱前衍生化,之后采用荧光检测器进行分析,获得了较好的色谱保留和仪器响应,见图2。
1.4微囊藻毒素
—
——大分子量化合物微囊藻毒素(MC )是一类单环七肽物质,一般结构为环D －丙氨酸－L －X －赤－8－甲基－D 异天冬氨酸－L －Y －Adda －D －异谷氨酸－N －甲基脱氢丙氨酸。
MCs 对环境及人类健康的危害已引起世界各国的普遍关
注。1998年世界卫生组织(WHO )出版的《饮用水卫生基准》中
建议饮用水中MCs 标准为1.0μg /L ,英、美等国限定天然水体及饮用水中的MCs 含量为1.0μg /L ,加拿大健康组织认为饮用水中可接受的MCs 标准为0.5μg /L 。中国尚未制定饮用水中MCs 总含量标准,在2001年6月卫生部颁布的《生活饮用水卫生规范》中将MC －LＲ的浓度暂行基准值定为1.0μg /L 。国
家环境保护总局颁布的
《中华人民共和国国家标准》(GB3838－2002)中在集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限值中列出MC －LＲ的标准值同样为1.0μg /L 。
目前MCs 的检测技术主要有生物分析法[14]
、细胞毒性检测法[15]、酶联免疫吸附法(ELISA )
[16]
、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA )
[17]、高效液相色谱法(HPLC )[18
]、高效液相色谱/质谱法(LC /MS )
[19]
等,而且陆续有新方法、新技术出现。这些方法技术由于原理不同而各有所长。我国生活饮用水标准GB /T 20466－2006中水中微囊藻毒素的测定方法为固相萃取－高效液相色谱法(HPLC )和酶联免疫法,最低检出浓度均为0.1μg /L 。
高效液相色谱法(HPLC )是WHO 、美英等发达国家和我国权威机构推荐的MC 检测方法。该方法具有准确、灵敏、重现性好,能同时分析出不同的MC 异构体等优点。但HPLC 监测技术往往需要标准毒素,而目前已发现60多种MC ,多数缺乏标准毒素,这限制了HPLC 的进一步应用。LC /MS 技术很好地解决了这一问题,即使没有标准毒素,只要知道这种毒素的分子量,就可对其进行定性,而且LC /MS 技术亦可对毒素进行精确定量。图3是本实验室测定水中7种MCs 物质的总离子流图
。
图3七种MCs 物质总离子流图(浓度:20μg /L )Fig.3TIC chromatogram of seven MCs compounds (20μg /L )
2前景和展望
高效液相色谱法(HPLC )主要应用于难挥发性有机物的分离分析,但是HPLC 方法只具备半定性能力,且针对痕量有机污染物灵敏度不够高;而液质联用技术(LC －MS )由于其高灵敏度和定性能力,近年来在环境监测领域逐步广泛应用,其技术的成熟和发展,使传统GC /MS 技术遗漏的髙极性、水溶性、高分子质量、热不稳定性污染物逐步被鉴定出来。该方法灵敏度高,重复性好,常作为国外研究者的首选。
目前环境污染物检测正从传统的基于色谱和低分辨色谱/质谱联用的靶标分析技术向基于高分辨色谱/质谱联用以及色谱/串联质谱联用的高通量、高灵敏、高选择、高甄别的非靶标分析方向发展。在色谱技术方面,全二维色谱和超高效液相色谱以其高通量、高分离、高灵敏成为很有应用前景的技术。在质谱检测方面,QTOF /MS 将在新污染物的定性、结构鉴定方面发挥更大作用。可以预想通过这些技术的联合将有更多潜在的污染物被甄别和筛选出来,而这些物质的鉴定正是进行环境安全评价和相关毒理研究的基础,并为未来环境监测指引了方向。
遗憾的是非靶标分析目前仍处于初步的试探性优化阶段,需要进一步加强方法的规范化和标准化。此外质谱数据库和标准品的缺乏,也是新型污染物准确鉴定的壁垒之一。在发达国家,高效液相色谱/串联质谱已经作为常规仪器在环境监测中普遍应用。而我国目前环境监测的标准化方法仍局限于气相色谱、气质联用等常规技术,环境分析化学研究相对滞后。为了在此领域取得突破性进展,应积极推动色谱/质谱联用技术的常规化使用。
