流式细胞仪-细胞凋亡检测
一 PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞 凋亡时在细胞、亚细胞和分子 水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA 可染性发生改变。研究 表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA 可染性降低。许多学者把这种DNA 可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测 细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫 荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂 与仪器 l PBS 溶液（配制方法见附录）；l PI 染液：将PI 溶于PBS （pH7.4 ）中，终浓度 为100ug/ml 。用棕色瓶4 ℃避光保存。l 70% 乙醇l 400目筛网l 流式细胞仪实验 步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5 ）×106 个/mL ｝，500 ~ 1000 r/min 离心5min ，弃去培养 液。2. 3ml PBS 洗涤1 次。3. 离心去PBS ，加入冰预冷的70% 的乙醇固定，4 ℃，1—2小时。(责任编辑：大汉昆仑王) |
