体内甲醛交联及染色质免疫沉淀--研究DNA和蛋白质作用
染色质由真核基因组包装而成，它参与了转录、复制、重组、修复等许多以DNA一蛋白质相互作用为基础的生化过程。研究者感兴趣的是这些过程涉及到哪些特异的基因或DNA序列,有哪些蛋白质参与。
尽管有许多人对染色质进行分类,就像Holde将其分为转录活性或非活性位点,但染色质构本身是动态的,并且DNA与非组蛋白相互作用常是瞬时的。因此极有必要发展一种方法,能够研究生理状态下DNA与蛋白质的结合,避免DNA结合蛋白在染色质上的重新定位或者在后续的生化分离中丢失。
由此产生了各种交联方法,也即将活细胞或分离的成分用交联试剂处理,如紫外光、甲醛DMS等,使蛋白质原位与DNA共价结合,研究两者的瞬时相互作用。DMs与紫外光联用尽管最近已成功用于研究体内DNA蛋白质相互作用,但是处理后对DNA造成损伤,故主要用于动力学上的研究。
而甲醛能介导蛋白质一蛋白质,蛋白质一DNA,蛋白质一RNA的交联,这种交联体外、体内均可进行,并且可被简单并全逆转,从而在生理状态下分别对DNA和蛋白质进行分析。另外甲醛交联的灵敏度高,交联效率也比紫外光高百倍。
综合以上优点该法已成为研究DNA和蛋白质体内瞬时作用的主要方法。甲醛交联的机制是DNA碱基上的氨基与亚氨基与蛋白质上的a氨基及赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基发生反应。
发展
甲醛交联及染色质免疫沉淀方法是综合利用了两种方法的优点。甲醛将蛋白质固定在DNA上,免疫沉淀分离交联的复合物,再经逆转对两者进行分分析。这种方法的成熟经历了漫长的发展历程。
最初使用甲醛作为交联试剂可追溯到上个世纪六十年代,当时分离的染色质或核经甲醛固定一定时间,用氯化艳密度梯度离心研究新合成的组蛋白沿着新复制的DNA的分布。上个世纪七十年代,aJckson报道了对甲醛介导的交联物进行逆转,电镜分析释放出的组蛋白。
上个世纪九十年代初,免疫沉淀用于分离固定的复合物,vasrhavshy等〔`〕使用组蛋白抗体研究DNA与转录的关系,从而形成了甲醛交联及染色质免疫沉淀的方法。上世纪九十年代,抗体滴度和特异性大大提高,比如针对组蛋白转录后修饰的乙酞化、磷酸化的特异性抗体相继出现,为染色质修饰和基因表达活性等的研究大开方便之门。
在染色质结构和动力学中的应用
甲醛交联及染色质免疫沉淀方法已成功用于研究染色质结构和染色质动力学等不同的领域中。研究对象涉及酵母、原虫、果蝇仁、人体细胞以及古细菌毛等多种生物;内容集中在与染色质直接相关的蛋白质;范围包括细胞信号通路,转录调节与组蛋白修饰的关系,古细菌核小体的组成等。
更为重要的是,该技术已在研究体内含量远小于组蛋白的其他DNA结合蛋白或复合物中获得成功。例如,果蝇中POYL-CoMB的基因组结合蛋白,以及哺乳动物T细胞和B细胞发育中,IK人ROS/HEHOS家族成员与中心粒异染色质区静默基因的关系。
近来该方法又取得了突破性的进展,用于分析转录因子与内源基因的体内结合,打破了以往必须依赖体外方法寻找转录因子的DNA结合序列的局限。2000年Yougn等发展了芯片方法,检测基因组水平上染色质蛋白的定位分析,这使得甲醛交联及染色质免疫沉淀技术的应用更加方便、快速。
实验介绍
将免疫沉淀与甲醛交联联用,首次鉴定出的是酵母中转录因子的目标基因序列。利用酵母作为研究材料一个很大的优点是其基因组已全部测序,因此可直接设计引物对免疫沉淀下的染色质作CPR验证目的蛋白的DNA结合序列。
但是在生物发育中有许多调控因子是酵母所没有的,eBne等改进了方法用于寻找高等哺乳动物中DNA结合蛋白调控的基因序列。本实验室将几种方法加以综合,基本步骤见图1,详细的操作程序可参考文献。
在这里需要指出的是,由于甲醛还介导了蛋白质与蛋白质之间的交联,所以该程序使用丙酮回收免疫沉淀下的蛋白质,可以分析特定DNA序列上的蛋白质复合物。不过要注意在交联物逆转时不能用蛋白酶K消化,而直接用丙酮回收有机相中的蛋白质。
结语
细胞内有许多调节机制都是通过蛋白质的转录后修饰,蛋白质之间的相互作用,蛋白质与DNA间的相互作用等瞬时又严谨的变化来实现的。甲醛作固定剂,就好比是染色质瞬时事件的摄相机,免疫沉淀又能通过合适抗体的选择富集特异的目的蛋白及相关DNA,而基因序列的富集更为重要。
所以甲醛交联及染色质免疫沉淀的方法,开创了DNA一蛋白质体内相互作用研究的新时代。随着染色质研究兴趣的提高及高滴度、高特异性蛋白质抗体的获得,该方法已成为体内研究染色质相关课题的优选方法。
