细胞器的光镜观察(1)
[实验用品]
1.材料：洋葱鳞茎、口腔上皮细胞、盖片培养的单层动物细胞、蟾蜍肾脏切片；猫或兔的脊神经节切片、马蛔虫子宫切片。
2.器具：光学显微镜、载玻片、盖玻片、小镊子、吸管、牙签、吸水纸、擦镜纸、剪刀、恒温水浴箱、小培养皿、小染色缸、大平皿。
3.试剂：中性红-詹纳斯绿染液、6mmol/l ph6.5磷酸缓冲液、m-缓冲液、2% triton 、x-100液、3%戊二醛、考马斯亮蓝染液、ph7.0，1/15 mol/l磷酸缓冲液。
[实验内容与方法]
一、线粒体的活体染色
(一)原理
线粒体是细胞内的一个重要的细胞器，是细胞内能量贮存和供能的主要场所。詹纳斯绿是线粒体的专一活体染色剂。线粒体内含有细胞色素氧化酶，当用詹纳斯绿
(janus green
b)进行染色时，细胞色素氧化酶能与詹纳斯绿发生氧化反应，线粒体呈现为蓝绿色，而周围的细胞质则被还原成无色的区域。若用中性红-詹纳斯绿混合染色，可使线粒体显示更为清楚。
(二)试剂配制
1. 1:15 000中性红水溶液：中性红5mg溶于75ml蒸馏水中。
2. 1%詹纳斯绿b染液：称取1g詹纳斯绿b溶于100ml蒸馏水中，稍加热(30～45°c)使之快速溶解，用滤纸过滤，即为1%原液,装入棕色瓶备用。为了保持其充分的氧化能力，最好是临用前现配。
3. 1%中性红溶液：称取0.5g中性红溶于50ml蒸馏水中。
4. 中性红一詹纳斯绿染液：
a液：将6滴1%詹纳斯绿水溶液加入到10ml无水乙醇中，然后再加入2ml 1:15 000中性红水溶液，并用黑纸包好贮于冰箱中。
b液：在10ml无水乙醇中，加入40～60滴1%中性红溶液。
将a液和b液混合在一起，即成中性红-詹纳斯绿混合染液。此液临用前配制。
(三)方法
1. 人口腔上皮细胞线粒体的活体染色及观察
（1）制片：将清洁的载玻片平放在桌上，然后在载玻片的中央滴2~3滴中性红--詹纳斯绿染液。用牙签的宽头轻轻地刮自已口腔壁的内侧
（刮的范围可稍大些，此步仅作为清洁取材面），将刮出物连牙签一起弃之。然后用另一支牙签宽头在原位刮取口腔上皮细胞于载玻片染液中混匀
(由于最表面的粘膜上皮细胞大都已衰老，代谢不旺盛，线粒体少，刮时可稍重些，尽量取较深部的粘膜，但以不刮出血为限)，盖上盖玻片，染色2～3分钟。
(2)观察：高倍镜下可见口腔上皮细胞的细胞质中，散在一些被染成亮绿色的粒状和短棒状的颗粒，即为线粒体。
2. 植物细胞线粒体的活体染色及观察
(1)制片：将清洁的载玻片平放在桌上，然后在载玻片的中央滴2滴中性红-詹纳斯绿染液。切开洋葱鳞茎，用镊子轻轻撕下洋葱鳞片的内侧面膜状的半透明内表皮，用剪刀剪下一小块（4mm2大小），放在载玻片的染料中，使其展开，染色20～30分钟。
(2)装片：在染色的载玻片上，用吸管吸取蒸馏水，滴于染色的载玻片上，使染液冲淡。盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分（加盖玻片时注意避免气泡出现）。
(3)观察：将做好的临时玻片标本，先用低倍镜观察，找到细胞后，转用高倍镜观察，可见洋葱表皮细胞胞质中含有液泡，细胞核位于细饱的中央或被挤至边缘，细胞质中有被染成蓝绿色的小颗粒，此即线粒体。
二、细胞骨架的显示和观察
(一)原理
用一定浓度的triton，x-100液（聚乙二醇辛基苯醚）处理洋葱鳞茎表皮细胞和动物细胞，可破坏洋葱鳞茎表皮细胞的细胞壁及洋葱鳞茎表皮细胞和动物细胞内的蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质被保留下来，经戊二醛固定处理和考马斯亮蓝染色后，能在光镜下观察到细胞骨架的结构。本实验显示的细胞骨架成分是以微丝为主组成的张力纤维。
(二)试剂配制
1. 6mmol/l ph6.5磷酸缓冲液：
甲液：nah2po4·2h2o，0.938g 溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000ml。
乙液：na2hpo4 ·12h2o，2.15g加蒸馏水溶解，最后加水至1 000ml。
取甲液68.5ml，乙液31.5ml加蒸馏水100ml即成6mmol/l ph6.5的磷酸缓冲液。
2. m-缓冲液(10×原液) ：咪唑34.04g，氯化镁 (mgcl2·6h20)1 020mg，egta (乙二醇双醚四乙酸) 3
800mg，edta (乙二胺四乙酸)290mg，巯基乙醇780mg (0.7ml)蒸馏水加至1 000 ml。使用时，取25 ml
(10×原液)加225 ml蒸馏水稀释。
3. 2%triton，x-100液：取22ml triton，x-100液加m-缓冲液至100ml。
4. ph7.0，1/15mol/l磷酸缓冲液
(1) 原液：
甲液：磷酸二氢钠 (nah2po4) 4.6g加双蒸馏水至500ml，加氯仿少许置4℃冰箱中保存。
乙液：磷酸氢二钠 (na2hpo4) 1.9g加双蒸水至500ml，加氯仿少许置4℃冰箱中保存。
(2) 使用液：甲液28ml，乙液72ml。加双蒸水至1 000ml，加氯仿少许常温下备用。
5. 3%戊二醛：取3ml 25%戊二醛ph7.0，1/15mol/l磷酸缓冲液至100ml。
6. 0.2考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝r250 0.2g，甲醇46.5ml，冰醋酸7ml，蒸馏水46.5ml。
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