偶联染料使用的成与败
在多色流式中常常会使用到偶联染料。然而由于偶联染料的特殊性，在使用上也有特殊要求，今天我们就来聊聊怎么用好偶联染料。
什么是偶联染料？
偶联染料由两个共价连接的荧光分子组成。这些分子之一是蛋白质（即PE，APC）或合成染料（即BV421™），其特征在于消光系数（吸收能量的能力）大的一方可作为供体，而第二个分子是作为受体的小型合成染料（即Cyanine5，Cyanine7）。
图1 常见的偶联染料分类和特性
我们为什么要使用偶联染料？
众所周知，一个样本可以同时使用的荧光素的数量受到流式细胞仪上激光器和检测器数量的限制（表1）。当前市场上最先进的细胞仪仪器有5种激光器，包括紫外线（355 nm），紫色（405 nm），蓝色（488 nm），绿色（532 nm）或黄绿色（561 nm）和红色（633 nm） ，并有可能在每个激光器上集成8个甚至更多参数。但是，目前还没有足够的光谱不同的荧光素来填充此配置。如果没有偶联荧光素，则每个激光器仅适合分开激发少量荧光素，从而严重限制了可检测参数的总额。
表1. 不同激光器、检测器和仪器下可用的多色流式panel示例（非最新配置信息）。
进一步扩大每个激光探测器的数量，使得多色流式panel可以增加到21种颜色/ 23个参数（表1）。也正是因为偶联染料具有激发供体受体发射的这种特性，才使得扩大多色流式panel可以实现。因此，尽管供体染料和其tandem被相同的激光激发，但是通过使用不同的检测器读出它们的发射光，它们可以在同一panel中使用。举例来说，图1展示了BV421™及其偶联荧光素的激发和发射光谱。
假使想更进一步扩展多色流式panel，可以使用光谱细胞仪来实现。该仪器目前最新的参数是可配置五个激光器，64个荧光检测通道。以Cytek® Aurora为例，Cytek成功开发了一个40色的免疫分型方案，仅从一根试管中进行细胞获取，便可获得具有出色分辨率的实验结果。光谱检测系统没有利用传统的补偿计算方法，而是允许同时使用具有显着重叠发射光谱的荧光团（即BV750™和BV785™），无需担心补偿问题。
图2. BV421™及其偶联荧光素BV570™，BV605™，BV650™，BV711™，BV750™，BV785™的激发和发射光谱。
偶联染料如何工作？
供体荧光团吸收特定波长的光能，激发后，能量通过称为Förster共振能量转移（FRET）的现象（也称为荧光共振能量转移）从供体转移到受体。受体以荧光的形式发射转移能量。当FRET效率很高时，将在受体通道中观察到强信号，而在供体通道中观察到弱信号。请注意，FRET效率永远不会达到100％，这意味着在供体通道中会有一些溢出或渗漏。当然这取决于偶联染料的质量。为正确分析，建议使用同型对照作为背景，单染对照来适当地调整补偿，FMO（(Fluorescence-minus-one）对照来画门。
我在供体通道中看到了荧光信号。我的偶联染料是否降解了？
没有。这是一个常见的误解。供体和受体染料共价结合，通常供体和受体不会在溶液中分开，不会降解。如前所述，由于FRET效率不是100％，因此在预期中便有荧光溢出或渗入供体通道。为了准确地补偿溢出，重要的是使用与多色样品相同的抗体作为单色补偿对照，并与多色样品一样去处理它们，尤其是在一样的光照和固定条件下。但是，如果在供体通道中观察到强信号，在受体通道中观察到弱信号，则表明FRET效率低，可能是由以下因素引起的：
光漂白。所以需要始终保护偶联染料免受光或其他氧化应激源的影响，因为它们极易受到氧化引起的光漂白。这种情况下会导致偶联功能丧失，并且不可逆。
暴露在冷冻温度下。不要冷冻偶联荧光抗体，它可能导致基于蛋白质的供体荧光团变性。
固定和通透性。不要长时间将细胞置于固定液中，因为这会导致自发荧光增加，并对偶联造成成更大的伤害。强烈建议固定后清洗细胞，并用FluoroFix™缓冲液（Cat#422101）替换普通缓冲液。虽然固定后也可以进行表面染色，但是，请务必查看我们的“fixation”页面（https://biolegend.com/fixation）以了解我们的抗体克隆与固定液的兼容。
不同固定剂会如何影响偶联染料荧光信号？这里有个例子，图2展示了用PerCP/Cyanine5.5-偶联抗体染色细胞并暴露于1％PFA或True-Phos™ Perm缓冲液（Cat#425401）中，再来看细胞的荧光信号。由于PerCP偶联荧光是一种基于蛋白质的染料，所以当它暴露于基于甲醇的True-Phos™ Perm缓冲液中会导致PerCP变性，以致PerCP信号丢失，但不会导致其受体Cyanine5.5失去信号，该受体的荧光可以在AlexaFluor® 700通道中检测到。
图3. A 暴露于1％PFA或True-Phos™ Perm缓冲溶液中时，PerCP/Cyanine5.5抗CD14抗体染色的荧光强度。B点图，表明将PerCP/Cyanine5.5暴露于True-Phos™ Perm缓冲液后，AlexaFluor®700通道中出现的信号。
成功使用偶联荧光抗体的小秘诀
避免长时间暴露在强光线下，以及减少温度剧烈变化。光线会使偶联荧光光漂白，始终保护样品和抗体免受光照。不要冷冻偶联荧光抗体，因为这可能导致供体蛋白变性。
避免“过分固定”。我们建议在短时间内（不到30分钟）固定偶联荧光，然后将其清洗并重悬在Cell Staining缓冲液中进行保存。为此，我们提供了专门配制的FluoroFix™缓冲液（Cat#422101），用于固定偶联染料。
对带有偶联荧光的多色流式实验进行检测时，请注意受体分子的跨激发光激发。在大多数情况下，可以通过补偿来分析。例如，已知PE/Cyanine5中的Cyanine5受体可被红色激光激发，因此与APC结合使用时要格外小心。
在4°C或冰上标记细胞。APC偶联荧光可能容易受细胞介导的去偶联作用，因此在低温下减慢细胞新陈代谢可以帮助保持偶联的稳定性。
为避免基于Cynanine的染料（即PE/Cyanine7，APC/Cyanine7）与单核细胞和巨噬细胞非特异性结合，我们建议使用True-Stain Monocyte Blocker™（Cat# 426103）。
