蔡宗苇：质谱成像前景广阔 分子水平探索生命奥秘
分析测试百科网讯 去年底英国分析科学家网站评选的2020年度全球最具影响力的60位分析化学家榜单中，香港浸会大学蔡宗苇教授获得殊荣。蔡教授在环境和生物分析领域造诣深厚，并擅长质谱基础理论与应用研究，近年来在大热的质谱成像领域做出多项前沿性的探索，并应Wiley邀约发表了关于复杂体系三维定量质谱成像的系统性综述。近日，分析测试百科网采访到蔡宗苇教授，他结合自己的工作介绍了质谱成像的进展，并展望了未来的挑战和机遇，期望对所有关注质谱成像前沿领域的研究者们有所帮助。
香港浸会大学化学系讲座教授、环境与生物分析国家重点实验室主任 蔡宗苇教授
质谱分析为主 三大研究方向
蔡宗苇教授首先简单介绍了环境与生物分析国家重点实验室，这是香港浸会大学唯一的一所中国科技部批设的国家重点实验室，结合其在持久性有机污染物（POPs）分析方面的多年研究经验和良好基础，通过与生物科学、环境科学和材料科学等交叉与渗透，建立以蛋白质组学、代谢组学、生物传感和生物成像为重点的生物分析平台，瞄准POPs环境与健康研究的国家需求和学科前沿，提出环境和生物体中POPs的分析测试新原理，建立分析测试新方法、新技术，研制新型检测仪器或装置，为提高国家环境品质和健康水准，以及履行国际公约提供重要的科学和技术支撑。
环境与生物分析国家重点实验室
蔡宗苇教授表示，环境与生物分析国家重点实验室共有三大研究方向，一是持久性有机污染物环境行为的分析和研究，包括迁移、变异、降解等；二是持久性有机污染物相关的人体健康疾病等研究；三是质谱方面的分析方法开发和分析仪器开发。
“我们是一个以质谱分析为主的实验室，近几年的研究方向除了蛋白质组学、代谢组学等多组学研究以外，更关注于开发质谱成像技术，特别是将质谱成像相关技术应用于环境污染和毒理研究。”谈到质谱成像技术，蔡教授表示，“我们的研究对象，既包括污染物的相关生物标志物代谢分析，也包括生物体内的内源性代谢物成像分析。”
蔡教授举了两个例子。乳腺癌可能是由于内分泌干扰物在动物体内长期暴露引起了乳腺癌的增殖、增发和恶性过程，课题组开展的乳腺癌质谱成像研究发表在《色谱》和Journal of Hazardous Materials期刊[1,5]上。另一个例子是关于孕鼠妊娠后暴露于PM2.5环境下的整个过程的质谱成像分析。区别于传统环境毒理学的研究方法，研究结合质谱成像和组学技术以及分子生物学技术，分析了妊娠期PM2.5对子代鼠认知和情绪发展的影响，为探索跨代际PM2.5毒性与神经退行性相关疾病的研究提供了重要信息。该研究对孕鼠组织、胎盘，孕鼠生产的小鼠进行生物分析、质谱成像分析，尤其对大脑组织进行质谱成像。研究发现在PM2.5长期暴露以后，污染不仅会从母鼠传递到子鼠，还会对小鼠的行为学产生影响，尤其对雌鼠更明显。通过3种行为学测试，发现PM2.5的暴露对孕鼠生产的小鼠的认知行为情绪影响非常大，甚至妨碍了大脑组织。因此，研究团队假在设研究对象后，对小鼠大脑里的生物标志物成像，基本可以获得污染物相关的生物标志物和毒性作用的靶器官,该研究已发表于Science Bulletin [2]。目前，课题组还在进一步研究神经行为学影响情绪行为的机理。
代表性脂质小分子(SM (d44:1))在小鼠组织中的空间分布: (a) 完整胎儿3D质谱成像； (b)胎儿2D质谱成像； (c) 成年子代小鼠脑成像
课题组还开发了一些创新的质谱成像方法，研究如3D细胞球里的污染物分布和空间分布；污染物在3D细胞里所引起的毒性，造成的生物标志物变化等。除了开发质谱分析方法外，课题组还开展一些对疾病、尤其是污染物引发的疾病和人体健康的研究。
质谱成像发展的源动力
两大特征
蔡宗苇教授总结了质谱成像的几大特征。首先，同其它成像方法不同，质谱成像（MSI）是一种分子水平上的成像技术，通过研究生物体整体的代谢组、脂质组和蛋白组的变化，用直观可视化的形式展现结果。由于质谱检测的是分子离子，质谱成像具有非常大的发展空间，其主要的分析对象是一些化学物质的代谢，不管是代谢物，还是污染物，以及与代谢物相关的蛋白或是DNA/RNA等，对其进行精准的定量和定位。
其次，质谱成像具有高通量、高灵敏度、免标记的特征。免标记非常重要，医学上很多检测需要荧光或者加一些显色剂标记，而质谱成像不需要标记，除非是为了更好的检测做的特殊化学标记。“对于2D和3D器官组织的分析，以及我们课题组开发的3D细胞球的技术，质谱成像已广泛用于细胞组织和人体肿瘤组的生物小分子、大分子甚至金属离子的定性定量。”蔡宗苇接着说，“金属离子成像也是一个非常重要的方向，但我们现在的仪器还检测不到，要测金属可能要连接到ICP-MS，或者Cell metric那种更高端的成像仪器。”
面临挑战：任重道远
蔡宗苇教授也谈到了挑战：“质谱成像虽然发展很快，涌现很多NCS好文章和综述文章，但我个人认为尚处于初级阶段，还有很多明显的限制。比如小分子代谢物的成像分析、组织体内的成像分析，目前比较成熟的方案限制于脂质Lipid，虽然一些高端研究中特别好的结果也展示了其可分析多肽、蛋白和其它代谢物，但质谱成像用于蛋白常规分析的前路还很长。基础研究和应用研究方面都需要研究者们继续改进和发展。我希望仪器公司也能够配合开展研究，一同不断发展质谱成像技术。”
质谱成像近年来是研究热点，蔡教授去年发表的关于复杂体系三维定量质谱成像的系统性综述[4]，已经被评为高引用率文章，综述了质谱成像当前的研究热点和未来的发展方向。简单来说，目前重要的一大研究热点探索简单的样品处理方法，因为组织处理难度极高。现在很多人做不好质谱成像，主要是因为做不好样品前处理。样品前处理包括冰冻、切片、喷基质等环节，样品处理不好，有再好的仪器也不行，而且还会影响整个检测的稳定性和重复性。
第二是要开发更好的激光采样的质谱成像技术，这离不开仪器公司的努力。蔡教授认为，现在的分辨率仍是瓶颈。当前几十微米的空间分辨率，尚不能满足单细胞成像分析的要求。蔡教授课题组研究了3D细胞球技术，即把大量的细胞聚集在一起，将球切下来分析。提高质谱成像分辨率对生物分析、生命科学分析至关重要。质谱成像预期可应用于实时呼吸系统的吸收，动物体内的生物标志物或药物分析，研究污染物在体内的转换、代谢和消除。质谱成像技术可以从整体上研究如从肾到肝等器官之间代谢污染物的变化和转移、肝脏的代谢过程等。
第三是需要能进行大量数据处理的软件。迄今为止，无论哪家仪器公司的质谱成像分析，进行大量数据分析需要耗时很长，而且一旦做数据处理就可能影响仪器使用，所以需要高效率且好用的软件。
第四是在环境毒理研究方面，希望质谱成像技术可以实时观察动物、细胞在环境污染物中的暴露过程。当前虽然TOF类气溶胶质谱已可以监测环境污染物，但还无法进行质谱成像。在此方面，除了对暴露过程进行质谱成像，还需实现质谱成像仪器的小型化。
亚洲首台！从rapifleX到timsTOF fleX MALDI-2
2016年5月，布鲁克亚太地区第一台 rapifleX MALDI Tissuetyper在香港浸会大学环境与生物分析国家重点实验室顺利完成安装。随着近日亚洲首台timsTOF fleX MALDI-2的成功安装，双方的合作越来越紧密。
布鲁克timsTOF fleX MALDI-2的离子源可将小分子和脂质分析的灵敏度提高一到两个数量级，进一步扩大MALDI质谱与基于MALDI技术的质谱成像应用范围。timsTOF fleX通过将PASEF与平行反应监测（PRM）相结合，使其非标记定量蛋白质组学性能得到了进一步增强，提高了多肽离子的选择性和灵敏度，增加了靶标离子的数目。
环境与生物分析国家重点实验室质谱成像实验室
蔡宗苇教授回顾和布鲁克合作的经历时表示，自己是布鲁克autoflex的早期用户，曾尝试过成像分析，2016年购置Tissuetyper后开展质谱成像研究并发表了系列文章。这次购置的是配置nanospay离子源、离子淌度和MALDI-2的timsTOF fleX MALDI-2。
布鲁克timsTOF fleX MALDI-2
在这套强悍配置的仪器上，蔡教授有几大期待。首先，希望其在进行蛋白质组学研究时具有更高的灵敏度，因为PASEF的离子利用率极高并配置了nanospray源。
其次，开展离子淌度的分析。蔡教授表示：“我本人尚未体验过离子淌度，但我非常喜欢这项重要的质谱三维分离技术。期待它能帮我开展许多以前无法实现的质谱分析，特别是同分异构体的分析，其中包括有机物、生物标志物、脂质，比如很多lipids有支链、直链、开链的差别，今后预期可以区分它们。还希望借助离子淌度开展一些基础性研究，特别是尚未报道过的特殊的脂质（Specific lipids），它们也许是人类健康所需，也可能是生物体中最重要的生物标志物。”
第三，最期待的是开展更好的质谱成像工作。比如对于Lipid的成像，2个激光预期可获得更好的灵敏度，而数百个Lipids中的同分异构体可以用离子淌度分离。更重要的是MALDI-2的成像分辨率更高。据文献报道[3]，透射模式t-MALDI-MSI的空间分辨率可达到1μm或更小，这种无标记方法可以表征（亚）细胞水平上的组织和细胞中化合物的空间分布。但是，该技术的主要局限是小像素尺寸下离子丰度会降低。MALDI-2是一种能提高脂质和代谢物离子丰度并扩大化学覆盖范围的有效方法。将两种技术结合，应用于组织和细胞的脂质检测，可以实现高空间分辨和高通量的质谱成像分析。
除了对硬件性能的期待，由于未购买所有的软件，蔡教授也期待布鲁克在软件方面提供更多的支持。“当年我们购置Tissuetyper是亚洲第一台，之后我做长江学者工作的广东工业大学也买了2台；这次购置MALDI-2又是亚洲第一台，听说又有两家订了，他们也曾向我咨询。”两次作为最新款产品的亚洲首个用户，蔡教授对于产品初期的使用和反馈对企业都有极大的帮助。
在应用方面，蔡教授希望MALDI-2在小分子的质谱成像方面发挥更大的威力，包括前文介绍的小分子生物标志物、内源性代谢物、脂质等。蛋白的质谱成像分析一直非常困难，需在组织上进行，选择抗体后再酶解分析。“分析一个丰度非常高的蛋白当然没有问题，但是经常是没有意义。真实的需求是要分析在组织中几千个蛋白中、低丰度的、有意义的那些蛋白。我很期待新的仪器能够开展一些蛋白的成像分析，可借助布鲁克或其它公司开发的软件计算分析。”
高水平工程师的大力支持
蔡宗苇教授非常感谢布鲁克在研究方面提供的支持：“当时我们的rapifleX MALDI Tissuetyper是亚洲第一台用于实验室科研的。布鲁克日本的工程师Takashi Nirasawa给了我们很多技术建议，帮助我们解决了初期的许多问题，尤其在小鼠乳腺癌分析方面。”
今年，蔡宗苇课题组在Journal of Hazardous Materials（9.038/Q1）[5]上发表论文，探讨了环境中典型内分泌干扰物双酚A(BPA)及其替代品双酚S(BPS)的暴露与乳腺癌发展密切相关的分子机制。研究以环境相关暴露剂量的BPS处理乳腺癌裸鼠移植动物模型，采用脂质和蛋白的质谱成像结合分子生物学的方法，对相关的分子机制进行初步探索。研究发现乳腺肿瘤体积随BPS暴露浓度升高呈减小趋势，并发现了肿瘤异质性驱动的增殖和恶性病变机制。其中，蛋白的质谱成像方法采用原位酶解法，并构建了人乳腺癌相关的数据集进行质谱成像蛋白图像的比对和搜索。
BPS诱导乳腺肿瘤增殖和恶变的分子机制
蔡宗苇教授强调：“即使我们擅长质谱分析，刚开始对质谱成像也是一知半解，仅靠看文献和看书是非常困难的。布鲁克工程师给予我们很多帮助，使我们能够能够尽快上手。在这篇研究文章中，为了感谢这位日本工程师Takashi Nirasawa，我们还将他列为共同作者。”
另一项工作发表于2018年Anal. Chem.[6]上，将MALDI-TOF rapifleX (Tissuetyper)质谱成像仪和生物分析方法相结合，研究双酚S暴露小鼠的肾脏毒性，从双酚S引起的脂质分子空间分布特异性来深入探讨污染物的毒性作用机制。文章末尾也致谢了布鲁克，尤其是其在提供软件方面的帮助。
需要专业性的培训和讨论
蔡宗苇教授也就促进质谱成像技术的发展和应用发表了个人的看法：针对这一研究热点，要多组织专业性的训练和讨论，防止买了仪器却不会用的现象。比如，举办质谱成像相关的学术会议，促进交流和学习；也需要仪器公司花精力组织培训，比如借助某个学术会议组织会前workshop，甚至将仪器安装在现场进行指导训练，这对质谱成像技术在中国的发展和应用很重要。
参考文献
1.质谱成像技术及其在乳腺癌研究中的应用.色谱, 2021, Vol. 39›› Issue (6): 578-587.DOI: 10.3724/SP.J.1123.2020.10005
2.Airborne fine particulate matter induces cognitive and emotional disorders in offspring mice exposed during pregnancy. Science Bulletin, Volume 66, Issue 6,30 March 2021, Pages 578-591
3.Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. M. Niehaus, et al. Nature Methods，volume 16, pages925–931(2019).
4.Three‐dimensional quantitative mass spectrometry imaging in complex system: From subcellular to whole organism. Mass Spec Rev. 2020；1–19.
5.Breast cancer proliferation and deterioration-associated metabolic heterogeneity changes induced by exposure of bisphenol S, a widespread replacement of bisphenol A. Journal of Hazardous Materials. Journal of Hazardous Materials, Volume 414,15 July 2021, 125391
6.MALDI-MS Imaging Reveals Asymmetric Spatial Distribution of Lipid Metabolites from Bisphenol S‑Induced Nephrotoxicity. Anal. Chem.2018, 90, 5, 3196–3204
400-6699-117 转 2005
