单细胞 DNA 和 FISH 分析应用于植入前基因诊断实验2
单个卵裂球 FISH
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| 实验步骤 | 1.大于 8 细胞的胚胎一般分离 1 或 2 个卵裂球，并尽可能快地，轻轻地将卵裂球从活检针中释放至活检培养基中。 2.将持卵管上的胚胎释放，并转移出活检滴 (小心避开活检好的卵裂球），转移至新配制的胚胎培养基和洗涤培养基中，平衡 1~2 h 后置培养箱中培养。将含有卵裂球的培养板放在热板上，直到所有的胚胎活检完成。 3.用 80 um 孔径的微管将卵裂球转移至一含有低渗/部分固定液的 Nunc 四孔板中（每孔中加人 1 个卵裂球），室温下放置 45s。 4.将 Nunc 培养板中的卵裂球转移至带刻蚀环的 Clay Adams 玻片上。 5.除去玻片上多余的液体，注意不要让卵裂球完全干燥。轻轻地在卵裂球上滴加 2 或 3 滴 3:1 固定液。 6.在相差显微镜上找到卵裂球，检查细胞核，用坐标或玻片定位器检测卵裂球的位置并记录好。用铅笔编号和标记好玻片。 7.重复第 3~6 步，将每一个卵裂球分开放置于不同的玻片上。 8.准备杂交混合液母液 (每个卵裂球需 10 ul)，母液含 3 种 Vysis 探针。按下述方法配制 (也可按厂家要求）： LSI 杂交缓冲液 7ul 探针 1 1ul 探针 2 1ul 探针 3 1ul (如果只有 2 个探针则用 1 ul 水代替）
9.将探针和杂交缓冲液置于 37°C 水浴箱中预热 5 min，使其达到室温。点离 1~3s。 10.按照第 8 步将探针和杂交缓冲液混合好。 11.点离 1~3s。
12.室温下，将玻片分别置于各含 70%、80%、90%、100% 乙醇的染色缸中脱水 2 min。 13.将第 8~11 步配制好的 10 ul 杂交混合液加到带刻蚀环的 ClayAdams 玻片上 (含有卵裂球），用 18 mm2 盖玻片盖上，周围用橡皮泥小心封好。 14.将含卵裂球的玻片和探针在 80°C 变性 3 min。 15.在 37°C 的湿柜中过夜 (有些探针所需时间要短些）。 16.将盖玻片和橡皮泥移走，用 60%(或 50%，按厂家要求）甲酰胺 (45°C 搅拌预热 IOmin) 冲洗玻片。 17.将玻片转移至 2XSSC，室温下放置 10 min。 18.将玻片转移至 2XSSC/0.1% NP-40, 室温下放置 5 min。 19.加 10 ul DAPI Ⅱ 至玻片上染色，盖上 24 mm X 50 mm 盖玻片。荧光显微镜下观察。 支持方案 5 探针验证对于所有 PGD 适应证的患者来说，在应用探针进行 PGD 检查之前，应常规地对夫妻双方外周血淋巴细胞 (细胞中期或间期) 进行检查以确认是否为染色体重排携带者。如果可能的话，探针也需要在卵裂球上验证，没有卵裂球则用其他类型的细胞 (如绒毛细胞) 也可。 1.夫妻双方的外周血淋巴细胞培养，收获中期分裂相细胞 (单元 4.1) 2.应用探针 (分开或混合) 对患者 5 个中期分裂相细胞进行杂交 (单元 4.4)。 3.DAPI 染色 (单元 4.3) 提供带纹染色体，荧光显微镜下观察，记录探针位置。 4.利用混合探针对夫妻双方外周血淋巴细胞进行杂交，计数 200~250个细胞，计算杂交效率： 杂交效率=有杂交信号细胞数/检测细胞总数 5.利用混合探针对绒毛细胞进行杂交，计数 200~250 个细胞，计算杂交效率。 展 |
