从外周血淋巴细胞中提取RNA
实验概要
本实验从外周血淋巴细胞(PBls)中分离得到RNA样品。
主要试剂
1. Ficoll(Amersham Biosciences)
2. 冰冷磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 7.4
3. 裂解缓冲液：5mol/L单巯基氰酸胍，10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，50mmol/L Tris—HCl，1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，用0.45微孔滤膜过滤
4. 4mol/L和3mol/L氯化锂，高压灭菌
5. RNA溶解缓冲液：0．1%SDS，lmmol/L EDTA，10mmol/LTris—HCl，pH 7．5，高压灭菌
6. 3mol/L乙酸钠，pH 4．8，焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理 (加0．2ml DEPC/100ml溶液)并灭菌
7. DEPC处理过的水 (0．2ml DEPC/100ml水)，高压灭菌
8. 用Tris平衡的酚(Sigma)
9. 氯仿；异戊醇(24：1)(Sigma)
10. 100%乙醇，-20℃
主要设备
1. 30m1Corex管，酸洗并硅化
2. 预冷离心机和吊桶式转头
实验步骤
1．收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。
2．用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。
3．在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞，并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108个外周血淋巴细胞)，然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。
4．加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂，4℃孵育15～20小时(过夜)。
5．将悬液转移到30mlCorex管内，在吊桶式转头内4℃离心2小时，6500r/min。
6．弃去上清，并用Kimwipe擦拭试管口。用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬，收集沉淀.将沉淀重悬液离心，6500r/min 1小时。
7．弃去上清，用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下，彻底冷冻悬液。
8．复溶悬液，每10分钟涡旋20秒，共45分钟。
9．用等体积酚抽提1次，并用等体积氯仿抽提1次。
10．加入1/10体积的3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积一20℃乙醇。彻底混合溶液，并在-20℃下孵育过夜。
11．在吊桶式转头内离心RNA，12000r/min 30分钟。用0.2m1DEPC处理水重悬沉淀。将溶解的DNA转移至1.5m1微量离心管内，并加入1/10体积3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积-20℃乙醇，重新沉淀。并以乙醇沉淀物形式保存RNA，直至准备使用时。
