| 实验步骤 |
第一部分：单链 cDNA 的合成
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
去除 RNA 酶的双蒸水
10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶缓冲液
MMLV 逆转录酶（100~200U/ul)
SUPERaseIN(20U/ul,Ambion)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L, 包含所有四种 dNTP)
随机引物（50umol/L)
总 RNA(1~5ug)
4. 放射性复合物
竞争性 RNA 转录本，109 拷贝（见方案 4)
5. 实验器材
薄壁的 PCR 管
二、方法
1. 在冰上向薄壁的 PCR 管中加 2ul 的 50umol/L 随机引物，一管用于 RNA 样品，一管用于竞争性 RNA 转录本。
2. 加 1~5ug 总 RNA 到样品管（最大体积为 10ul)。
3. 加 109 个拷贝的竞争性 RNA 转录本到相应管中（最大体积为 10ul)。
4. 在每管中加入 4ul 的10mmol/LdNTP 混合物。
5. 用去除 RNA 酶的双蒸水把体积增加到 16ul。
6.70°C 加热 10min，变性二级结构，然后立即放在冰上。
7. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。
8. 加 1ul 的 20U/ulSUPERaseIN。
9. 加 1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。
10.42°C 孵育 lh。
11.95°C 加热 10min 使逆转录踌失活。
12. 继续进行扩增反应，或-20°C 储存。
第二部分：PCR 扩增
这一方案中 PCR 扩增的宗旨与相对 RT-PCR 中描绘的相同（见方案 1)。方案设计包括6 个反应及额外的 10% 份额。这对于一个样品用 4 个稀释浓度的竞争子、1 个无竞争子的对照和 1 个无模板的对照是足够量的。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
去除 RNA 酶的双蒸水
10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶缓冲液
TaqDNA 聚合酶（5U/pl)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)
基因特异的正向引物（5umol/L)
基因特异的反向引物（5umol/L)
来自上述反转录反应的 cDNA
4. 放射性复合物
竞争性 RNA 反转录反应物（未稀释=5X107 拷贝/ul)
薄壁的 PCR 管
6. 专用仪器
可编程的 PCR 仪
二、方法
1.准备 PCR 反应混合物。
10XRT-PCR 缓冲液 35ul
10 mmol/LdNTP 混合物 28ul
5umol/L 基因特异的正向引物 14ul
5umol/L 基因特异的反向引物 14ul
5U/ulTaq DNA 聚合酶 1.75ul
去除 RNA 酶的双蒸水 236.25ul
2.平均在每个 PCR 管中加入 47ulPCR 反应混合物，共 6 管，分别标记 1~6, 在冰上操作。
3.加 2ul 准备好的模板 cDNA 到 1~5 号管中（见单链 cDNA 的合成）。
4.梯度稀释的反转录反应包含的竞争性 RNA 转录本如下。
未稀释：1ul 反转录混合物=5X107 拷贝/ul
稀释 102 倍：加 1ul 反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X105 拷贝/ul
稀释 104 倍：加 1ul 的稀释 102 倍反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X103/ul
稀释 106 倍：加 lul 的稀释 104 倍反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X101/ul
5.加 1ul 未稀释的竞争子到 1 号管中，对应 5X107 拷贝/ul。
6.加 1ul 稀释 102 的竞争子到 2 号管中，对应 5X105 拷贝/ul。
7.加 1ul 稀释 104 的竞争子到 3 号管中，对应 5X103 拷贝/ul。
8.加 1ul 稀释 106的竞争子到 4 号管中，对应 5Xl01 拷贝/ul。
9.加 1ul 去除 RNA 酶的双蒸水到 5 号管中，作为无竞争子对照。
10.加 3ul 去除 RNA 酶的双蒸水到 6 号管中，作为无模板对照。
11.在适当的配有热盖的 PCR 仪（例如 GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems) 上运行 PCR 扩增。扩增程序如下。
94°C 30s
退火温度 30s
72°C 30s
30 个循环
12.在含有
1ul/ml 溴化乙锭的 2%~2.5% 的琼脂糖凝胶上检验实验结果。每个反应上样
5ul，结果以转录本的量和拷贝数来表示。由于设计时竞争子具有与目的基因同样的反应动力学，可以与目的基因共同扩增，而且在每个反应中样品和竞争子
PCR 产物的量可以直接比较。竞争子获得的 PCR 产物的强度与来自于内源 RNA 转录本的扩增相一致，同等强度代表 RNA
样品中存在的内源信息。竞争性定量 RT-PCR 实验的例子如图 13-6。
13.
为了对影响竞争子和外源转录本的反转录效率的变量进行控制，要做一个最终的RT-PCR 实验，在这个实验中样品 RNA 和竞争子 RNA
在同一个管中被反转录。使用的竞争子 RNA 的量要接近于在初始 RT-PCR
实验中所提出的量，如前所述做反转录、扩增。如前所述，与内源信息产生同样信号强度的竞争子 RNA 的量代表了样品中内源信息的量。
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