DNA测序技术的现状和发展（三）

1.1.1 摩尔定律对454测序仪的影响

454测序仪的迅猛发展不是因为我们想要Sanger测序仪小型化，而是因为新型奔腾芯片的出现以及摩尔定律法则给我们带来的希望。很明显，常规的人类基因测序项目会对我们处理测序技术的能力提出更高要求，这与我们对计算机处理能力的要求是一样的。不过，只有将计算机的电子管换成晶体管，才为后来集 成电路技术的发展提供了可能，这正是计算机产业发展的关键所在。而希望对传统的毛细管电泳技术进行改良，提高它的速度和处理规模，正如只用电子管直接制作 集成电路一样不可能。因此，如果将各种测序技术比作一个个晶体管，将一系列测序步骤整合起来比作集成电路，那么也就可以用摩尔定律来预测DNA测序技术的发展速度了。

合成测序法概念虽然在提出的时候还不算成功，但它的出现为测序仪小型化奠定了基础。基于合成测序法出现了两种策略：一种是循环可切除终止测序法 （cyclic reversible termination technology），即依次逐个添加荧光标记的碱基，继而检测荧光信号，切除荧光基团，如此往复；另一种策略是焦磷酸测序法（sequenced by detecting pyrophosphate release）。454测序仪采用的正是焦磷酸测序法，因为它似乎比第一种方法的效率更高。结果证明，454公司的选择是正确的。454测序仪采用的是小型化焦磷酸测序反应，测序模板准备和焦磷酸测序反应步骤都是在固态芯片上完成的。

实际上，早在上世纪90年代中期，焦磷酸测序技术就已经被科研界用来进行基因分型工作了，但那时的焦磷酸测序技术还不能够满足标准的测序实验要求，因为它的测序长度太短，因此只能用于旨在发现SNP的基因分型研究当中。当时进行基因分型操作时，是在微量滴定板（microtiter plate）上进行的，可以连续进行最多96次基因分型实验，平均每个样品花费20美分。那时焦磷酸测序还不能用于从头测序工作，因为从头测序需要对每一个尤其是第一个碱基都能准确地区分清楚，而焦磷酸测序只能简单地对已知位点的碱基进行检测，而且从头测序要求的测序长度也是焦磷酸测序法无法达到的。

不过，由于焦磷酸测序的原理是通过检测碱基掺入时发出的光来进行测序的（图3），所以它并不需要类似于电泳之类的物理分离过程来对碱基进行区分。这 也就是说焦磷酸测序仪可以“缩小（减）”到只需要检测光线就够了，而不需要像传统的测序仪还需要电泳设备，而这正是限制传统电泳仪小型化的关键所在。发光检测方法还能够进行多路平行操作，但是直到454测序仪出现之前，还没有人这样做过，以前都是依次进行检测的。和晶体管早期的遭遇一样（当时人们也怀疑晶 体管替代不了电子管），人们同时对高密度的，用于并行焦磷酸测序的反应也充满了疑问。不过，当我们不再在溶液中进行测序反应，而是将测序模板、所有的试剂 （酶）都固定在平板上制成芯片之后，就获得了小型化的，能进行多路并行处理的测序仪，这就与晶体管被小型化并整合成集成电路的过程一样。此外，借助微量滴定板上一个个的小孔所达到的将不同测序反应进行分隔这一目的，也能通过在单个固相支持物上进行严密包裹（隔离）的反应来实现。在这些各自隔绝的反应体系中，链聚合反应速度和发光速度都能通过对反应试剂和产物弥散状况进行严密的控制来进行精密的调整。

1.1.2 新的并行试验方法

在开发新型高通量、高并行运行方法时碰到的一个关键问题是，如何将反应试剂同时加入数量如此之多的各个反应体系中？在焦磷酸测序的过程当中需要反复 加入不同的碱基以供测序反应使用，而当时的自动化加样设备无法有效地做到对这么多的反应体系同时循环加样。于是，开发一种全新的高密度并行处理方法这一重 要课题又再一次摆在了科研人员的面前。这一次，我们找到了一个非常简单但是又很巧妙地方法。在高密度的反应芯片表面使用层流（laminar flow）加样方式，反应试剂会通过扩散作用很好地进入每一个反应体系，而且也可以用层流的方式洗去多余的反应试剂。现在，所有的新一代测序仪都采用了这 种层流加样方法。

为了将每个单独的测序反应都分隔开来，我们一开始使用平板（芯片），不过在平板上平均每一平方厘米的面积上最多只能同时进行数百至数千个反应。但我们希望达到的是在每平方厘米的面积上同时进行100万个测序反应，这样才能令测序仪小型化，同时节省试剂并进行快速成像和测序。为了实现更高密度的测序反 应，我们在平板上制作了很多小孔，将每个反应体系都安置在这些小孔中，这些小孔都足够深，足以分隔每个反应体系。虽然这种方法极大提高了测序反应的密度， 缩小了平板的面积，但是要达到我们的要求还是需要60mm×60mm大小的芯片才行。

针对图像采集问题使用了商业化的天文学照相（astrological grade camera）器材，在电荷偶合装置（CCD）的表面连接上光纤束（fiber-optic bundle）。这些光纤是锥形排列的，这样可以将大范围的光信号都传输到CCD表面上很小的一个范围。采取下面两个步骤，我们就可以制成含有高密度小孔 的芯片：先将光纤束连接到类似于载玻片一样的一次性芯片上，然后用酸蚀刻（acid etching procedure）技术在玻片的另一面打上小孔。这种酸蚀刻技术是根据制作生物传感器的技术改进而来的。

454公司制作的每张芯片上可以达到数百万个小孔，每一个小孔都是一个独立的“反应站”，互不干扰，测序反应发出的光被连接在芯片上的光纤传送到CCD记录下来（图4）。这种芯片就好像集成电路一样一次可以同时处理数百万个测序反应。这种芯片同样也能被其它通过发光检测技术的产品所使用。454测序仪也没有像以前的96孔板焦磷酸测序仪那样使用液态的试剂，而是将试剂和模板统统都吸附在一个个微珠上，然后把这些微珠一个个地放到芯片上的小孔中，每孔一个微珠。这种固定步骤不仅保证了每孔测序反应的独立性，也极大地节省了试剂消耗费用。

要想实现高通量基因组测序，只对测序步骤进行优化还是远远不够的。人类基因组计划花费的30亿美元经费中有很大一部分都用在了测序样品制备阶段。当时即使是采用最简单的制备样品方法也需要将目标片段克隆到细菌中，挑克隆，再转到96孔板，然后进行克隆扩增，提取质粒，制备测序模板。这种工作流程既耗 时也耗钱。

如果采用新型的文库制备方法就可以极大地节省这部分开支，这种新型的方法是先分离基因组DNA，随机切割成小片段分子，然后通过有限稀释（limiting dilution）和聚合酶扩增反应，即体外克隆方式（clones without bacterial）制备模板片段。这样，从模板制备到最后的测序反应整个过程都能够在体外完成。

1.1.3 从发明到创新

从概念的提出到最后技术上的实现，454测序仪主要关注两个方面，首先是开发蚀刻光纤玻片；其次，改进焦磷酸测序方法使其能在固相支持物上进行，即将其改造成固态焦磷酸测序法，同时也对模板及文库构建方法进行了改进，让454测序仪能进行长片段测序工作和从头测序工作。

1.1.3.1 在蚀刻板上的小孔中进行固态、长片段焦磷酸测序反应

蚀刻技术经过改良之后能在75mm×75mm的玻片上刻出深55μm、宽44μm的小孔。而开发固态测序方法和改良测序长度则是两个紧密相关的问题，因为在固定的小孔中反应实际上就能改进测序质量和测序长度。由于反应试剂能迅速渗透到小孔中，因此反应速度也会加快。而且这里也没有使用三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）提取未参与反应的碱基，而是将芯片置入反应池中通过层流液体的快速渗透作用将多余的未参与反应的碱基和反应副产品洗掉，由此得到 100bp~500bp的测序长度。在能有效去除多余碱基的同时，每轮反应中聚合酶的效率也得到了极大提高。这样高效率的聚合反应使得454测序仪具有较长测序长度的同时也保证了高准确性，测序长度在200bp时的准确率高达99.5%。这是因为通过降低小孔中残存的未参与反应的碱基浓度，可以降低这些碱 基对聚合酶活性的抑制作用，或者降低这些碱基导致的延后错误（carry-forward error，即由于未参与反应的碱基导致的测序反应不同步现象）的发生率。454测序仪在测序长度和准确率方面具有优势还因为其在应用流体学、表面化学和 酶学（包括选择更好的聚合酶、在更高的温度进行测序反应以及更换及平衡各个酶组分）等方面都有创新（表4）。

还有一些能提高测序精度和测序长度的技术，不过暂时还没有商业化产品。这些技术包括使用可切除的终止碱基（reversible terminator）提高对同聚物（homopolymers）的检测精度；双末端测序法（double-ended sequencing），即同一模板的两条链均不测序；以及选择性酶固定法（alternative enzyme-immobilization method）等。这些技术改进还都没有用到测序仪产品中，有一部分原因是因为现在还没有必要使用。

注：蜜蜂群崩溃症（honeybee colony collapse），指的是来自养蜂业的蜂箱或自然界存在的欧洲蜜蜂群的工蜂突然消失的现象，又称作Colony collapse disorder（CCD)。