突破:4Pi超分辨显微成像技术的“禁地”破除
由于具有无损、高特异性等特点，光学荧光显微镜一直是生物实验室进行研究的必备之选。相较于二维成像，三维超分辨显微成像技术在生物研究中具有显著的优势。由于光学衍射效应（Diffraction Effect），经典的单镜头显微镜系统在轴向（厚度方向）的分辨率表现不佳——即使是新兴的超分辨显微成像技术也概莫能外。为了追求三维一致的分辨能力，研究人员开发了基于对置双镜头的4Pi显微镜架构，并进而开发了对应的超分辨版本。然而，由于鬼影效应（Ghost Image）和样品像差累积效应，厚样品成像一直是4Pi超分辨显微成像技术的“禁地”。
2021年5月31日，由多家研究机构组成的联合课题组在Nature Methods上发表文章Three-dimensional adaptive optical nanoscopy for thick specimen imaging at sub-50-nm resolution，提出了一种全新的、可用于4Pi显微镜架构的自适应光学（Adaptive Optics）策略，成功将4Pi超分辨显微镜的应用范围扩展到了全细胞、组织等较厚的生物样品。通过与isoSTED显微成像技术相结合，作者们首次在实验中从整个30-35 μm厚生物样品内稳定获取了三维亚50 nm分辨率，并藉此对一系列亚细胞结构进行了精细的三维成像。
为了实现上述目标，相对于原有4Pi超分辨显微镜特别是isoSTED，作者们做出了一系列开创性的系统升级（如图1）。首先，他们改变了激光器布局，简化了光路结构，增强了成像过程中的系统稳定性；进而使用空间光调制器（Spatial Light Modulator）进行光束整形以克服鬼影效应，打破了厚样品成像的理论束缚（否则，为避免鬼影影响，isoSTED显微镜的成像深度仅可以达到数百纳米）。其次，他们通过对光束的偏振调控，极大地降低了系统噪声水平。最后，基于早先推导的4Pi像差模型，他们耦合使用了两台变形镜（Deformable Mirror），建立了步进式的自适应光学像差补偿策略，以保证系统分辨率的稳定。针对标准样品（如：荧光颗粒样品或神经组织切片样品）的成像结果表明，无论是在表层还是深入样品内部，由作者们开发的4Pi超分辨显微镜均可以获得35-50 nm的三维、各向同性分辨率。
图 1 本文作者所开发的自适应光学isoSTED显微镜主光路设计渲染图。
在随后的实验中，作者们通过对于单细胞样品的成像，证实了他们的显微镜具有多色、三维、全细胞成像能力。对于各种不同的细胞器，如微管、联会附合体、高尔基体、内质网、线粒体等都具有很好的成像效果。如图2所示是他们对于高尔基体-囊泡的多色成像结果，从中可以很好地区分出高尔基体的层状结构。
图 2 对于HeLa细胞中高尔基体（Golgi Apparatus）和囊泡（COPI Vesicle）的成像结果。其中，绿色和洋红色分别为经过免疫荧光标记的GM130和βCOP蛋白。图a和b展示了同一成像区域的两个侧向切面。
相对于单细胞样品，对于组织切片样品的成像则更具有挑战性。由于组织样品的折射率分布更加复杂，大大增加了光散射背景噪声和像差。同时，为了避免压缩失真，组织切片的厚度需要达到单细胞样品的厚度，则使得高分辨率成像变得尤其困难。在本文之前，尚没有任何利用4Pi超分辨显微镜对于组织成功成像的报道。作者们利用他们开发的显微镜对于果蝇卵内的环沟（Ring Canal，也被称为胞质桥Cytoplasmic Bridge）进行了成像。成像结果（如图3所示）清晰显示了环沟上的HtsRC和F-actin蛋白在空间分布和数量上的巨大差异，为进一步揭示其关联功能提供了可靠的依据。此外，作者还利用相同的技术，对神经突触进行了成像，并进一步测量了前后突触蛋白Bassoon和Homer1之间的距离和统计分布，证实了他们显微镜在解决生物问题时的定量分析能力。
图 3 单个果蝇卵环沟的成像结果。图中，绿色和洋红色分别为经过免疫荧光标记的HtsRC和F-actin蛋白。
由本文作者们所建立的自适应光学策略以及基于该策略所开发的超分辨显微成像技术，不仅拓展了原有技术的应用范围，而且对于整个4Pi显微成像技术具有普适性，为更多生物学家使用4Pi超分辨显微成像技术解决自身感兴趣的科研问题提供了可能。此外，该技术路线也为探索更具突破性的显微光场调控方法，如多焦点并行探测技术，提供了很好的启迪。
本文的共同第一作者是现任浙江大学光电科学与工程学院研究员的郝翔博士、牛津大学的Edward S. Allgeyer博士和耶鲁大学的Dong-Ryoung Lee博士，本文的通讯作者是耶鲁大学的Joerg Bewersdorf教授。
