测序简史（二）
（3）原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失
从序列上看，DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。
图4 复杂结构引起的信号中断
2.出现套峰是什么原因？
在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结其形成原因有以下几点：
（1）测序引物在模板上有两个结合位点(图5)；
（2）模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆(图6)，如果是PCR,原因为非特异性条带(图7)；
（3）模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等(图8)；
（4）引物降解，或引物不纯(图9，图10)。
图5 双引物结合位点引起的套峰
图6 由于质粒或菌液为非单克隆引起的套峰
图7 PCR为非特异性条带引起的套峰
图8 模板特殊结构引起的套峰
图9 引物轻微降解或引物不纯引起的套峰
图10 引物严重降解或引物不纯引起的套峰
四、解决方案汇总
1.样品测序无信号
可能是引物结合位点不存在或被破坏；建议更换引物测序或重新提供样品测序。
2.样品测序信号差
可能是引物或模板的质量不高或是引物和模板的匹配性不好引起的，也可能是样品浓度偏低；建议提供高质量样品测序。
3.样品测序衰减
可能是由于特殊结构如Poly结构、重复序列、回文结构、发卡结构、GCrich、AT富集等导至的测序衰减，由于是样品本身结构问题无法优化建议反向测序进行拼接以得到完整序列，还有一种衰减的情况就是在一段正常峰型后逐渐衰减，可能是模板量反应量不足导至，建议制备高浓度模板测序。
4.样品测序套峰
套峰细分的话有如下几种情形:
①全双峰：多引物结合位点（针对菌液、质粒样品），非特异性扩增（针对PCR产物）；
②前双峰：多引物结合位点，其中一套模板测序中断（针对菌液、质粒样品），多引物结合位点（PCR未纯化样品），引物二聚体或小片段干扰（针对PCR已纯化样品）；
③中间双峰：非单克隆（针对质粒、菌液样品），碱基缺失或等位基因双模板（针对PCR未纯化样品）；
④后双峰：非单克隆（针对菌液、质粒样品），碱基缺失（针对PCR样品）；
针对二聚体及小片段干扰的情况建议电泳切胶回收纯化；针对多引物结合位点的情况建议更换引物测序或反方向测通样品；针对碱基缺失建议克隆测序；针对非单克隆建议在克隆无误的前提下重新挑取单克隆测序；针对非特异性扩增建议优化反应条件重新制备样品测序；针对等位基因双模板建议克隆测序。
5.样品测序中断
可能样品存在特殊高级结构，导至dNTP和ddNTP在某一碱基位点后无法与模板结合，测序酶无法继续延伸，建议使用反向引物进行测序经拼接后可以得到完整序列；或酶切后亚克隆测序。
6.样品测序移码
测序从开端发生移码可能是引物发生降解，建议重新提供引物；测序局部出现移码，可能样品存在特殊高级结构，建议反向测通。
7.样品测序底峰干扰
可能测序引物不纯，建议将引物进行PAGE胶纯化后在进行测序或重新提供引物测序；可能测序样品不纯，混有正、反向引物，建议重新制备样品测序。
第二代测序技术
一、简介
小编上大学的时候，二代测序技术主要有三家公司，罗氏的454技术，illumina的Hiseq和Solexa技术还有ABI的Solid技术。不管是哪家公司，其具体原理如何，暂且不说。他们都是边合成边测序，也就是说通过在序列合成的同时通过各种标记进行实时的序列识别。接下来，小编还没有毕业，罗氏和ABI的测序技术就提前毕业了。只剩下一家illumina。熟悉二代测序的，都清楚，他家是双端测序，通量高。Illumina基本上每天推出一款新的产品。并且通量越来越大，成本越来越低。说最近今年的例子，14,15年推出的Hiseq 4000 15,16年推出的X ten（10台hiseq X）国内有很多公司引进了这套设备。北京诺禾致源，药明康德等。目前国内的二代测序通量基本上满足了国内的科研需要和临床应用需求。由于先动优势，其他的测序公司也就放弃了在Xten市场上与诺禾进行角逐，转而成为诺禾测序市场上渠道客户。这样看来华小之间，相爱相杀。17年南京诺禾（背后有资本的力量，目前市场上的好多做健康管理，基因检测的都将从这里走渠道。），其实就是委托诺禾进行运营和管理，毕竟人家经验丰富。引入25台Novaseq测序仪。这些测序仪将主要用于生命科学健康方向。可以预见的将来，诺禾将成为二代测序市场的占用者，有一句话说的好，诺禾测序仪抖一抖，好几百家公司的数据都不合格。
由于二代测序需要对荧光信号进行识别，但是由于荧光信号较弱，因此需要进行扩增建库。也就是这一步导至二代测序存在偏好性。
二、主要应用方向
二代测序目前是科研市场上的主力，广泛的使用在物种基因组测序，转录组测序，群体测序上。另外这两年也在寻求医学上的发展，随着成本的降低，其在医学市场上的应用将会越来越多。
三、二代测序相关的名词解释
什么是高通量测序？
高通量测序技术（High-throughputsequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。
什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）
全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
什么是de novo测序
de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。
什么是外显子测序（whole exon sequencing）
外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
什么是mRNA测序 （RNA-seq）
转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA（包括mRNA和非编码RNA）的类型与拷贝数。Illumina提供的mRNA测序技术可在整个mRNA领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样品制备和数据分析软件支持在所有物种中的mRNA测序研究。
什么是small RNA测序
SmallRNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将18-30 nt范围的Small RNA从总RNA中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成cDNA再做进一步处理后，利用测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。通过Illumina对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的miRNA图谱，实现包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用。
