荧光光谱法在蛋白质研究中的应用
1. 利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的构象变化
利用蛋白质中的芳香族氨基酸残基的侧链基团具有吸收紫外区域的入射光从而发射荧光的特性，来研究蛋白质在变性或复性过程中整体空间构象的变化。其基本机理是: 荧光来源于生色团基团在不同电子能级之间的跃迁，荧光频率取决于能级之间的能量差，生色团基团与周围基团的相互作用可能会改变其处于激发态时所具有的能量，从而改变其发射荧光的频率与强度。同一种荧光分子在不同极性的环境中，其最大吸收波长可能会有所差别。一般来说，极性环境会影响生色团基团的基态和激发态能级，减少激发态的能量，从而引起发射谱的红移(使λmax增大)。在天然的蛋白质中，可产生荧光的芳香族氨基酸分子多处于蛋白质的内部，被多种非极性氨基酸残基包围，因此其所处的局部小环境的极性弱于蛋白质分子外部水溶液的极性。蛋白质变性过程中，芳香族氨基酸分子的侧链基团逐渐暴露于水溶液中，其所处的环境极性逐渐增加，因此蛋白质荧光发射峰的λmax逐渐增大。λmax红移的程度可以反映蛋白质构象变化的程度，红移程度越大则表明蛋白质在变性过程中构象变化的程度越大。反过来，蛋白质复性过程中，芳香族氨基酸分子的侧链逐渐内埋于蛋白质内部，其所处的环境极性逐渐降低，因此蛋白质荧光发射峰的λmax逐渐减小，称为λmax的蓝移。通过测定蛋白质λmax蓝移的程度，可以推算其整体构象变化的程度。 2. 利用荧光探针检测蛋白质的构象变化
由于荧光探针的荧光光谱对环境变化十分敏感，使得它对蛋白质分子的构象变化也就十分敏感。例如用ANS做荧光探针的时，它通过非共价结合到蛋白质分子的非极性区域中时，其荧光光谱会随着所处环境非极性的增加而发生蓝移，且荧光强度也随之提高，最大吸收/发射在375/500nm，在一定范围内，荧光强度与蛋白质的浓度呈线性关系。利用ANS的这个性质，可以衡量ANS结合的蛋白质部位的极性的变化，根据极性的变化又可以进一步推测蛋白质结构的变化。 3. 测定蛋白质的含量
利用蛋白质的内源荧光可以检测蛋白质的含量，主要有标准曲线和内标法两种。标准曲线法是在同样条件下，以已知量的标准荧光蛋白质配成不同浓度的标准溶液，将在荧光光谱仪上测得的值绘成标准曲线，然后再测未知样品值，利用标准曲线求出荧光物质的含量。内标法通常是在一定的浓度范围内，选择合适的标准蛋白溶液浓度，将其在荧光光谱仪上测得的值与在同样条件下测得的未知样品的值比较，计算求出未知样品的浓度。蛋白质中伯胺还可以与荧光胺反应生成发荧光的化合物，其荧光强度与蛋白质的含量成正比，因此可利用荧光胺测定蛋白质的含量，但必须预先测定已知浓度的标准蛋白溶液的荧光强度[3]。 4. 测定酶的活性
荧光光谱法是测定酶活性的一种方法，主要是根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定，其灵敏度要比紫外及可见分光光度法高若干个数量级，而且荧光强度与激发光的光源有关，因此在酶活性的测定中越来越多地被采用，特别是用于一些快速反应的测活性场合。荧光光谱法的一个缺点是易受其他物质干扰，例如酶本身的内源荧光的干扰。故用荧光法测定酶活力时，尽可能选择酶的内源荧光较弱的可见光范围进行测定。如乳酸脱氢酶(lac2tate dehydrogenase ,LDH)的活性测定，乳酸脱氢酶可催化乳酸与氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nico2tinamide adenine dinucleotide ,NAD+)的反应，NAD+被还原为原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadinine dinucleotide ,NADH) ,NADH能被强碱转换成荧光化合物，则可以测定其荧光强度，用于度量乳酸脱氢酶的活性。 5. 研究小分子与蛋白质间的相互作用
荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。在相互作用研究中常采用荧光猝灭法，荧光猝灭是指由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。荧光猝灭法分为动态猝灭和静态猝灭两种方式[4]。荧光猝灭法多用于研究生物大分子，如蛋白质与小分子药物或金属离子的相互作用，可引入外源性荧光作为探针，也可利用蛋白质自身的内源性荧光。借助荧光猝灭法可测得药物分子与蛋白质的结合常数及结合点数，再依据Forster能量转移机制可求出供体与受体间的结合距离及能量转移效率[5]。该法应用十分广泛[6-7]，且常与紫外可见吸收光谱法及圆二色谱法一起使用，相互验证。
