全自动临床化学分析仪常用项目检测方法介绍
前言
临床化学自动分析仪所涉及的测定方法包括终点测定法、连续监测法、免疫比浊法。下面是以Au5800为例对这几路种方法的简述。
术语
双波长
由主波长和副波长构成的两个波长，测定样品采用双波长可以消除对实验的影响。主波长是指测定某物质时，生成的产物颜色对光吸收的特有波长。副波长是指测定某物质时，为消除其他干扰物质在主波长造成测定干扰所设定的波长。
反应杯空白
在特定波长下，光通过以蒸馏水或空气为反应体系所测得的吸光度值。
试剂空白
在各特定波长下，光通过以蒸馏水或生理盐水为样品和相应测定项目试剂构成的反应体系所测得的吸光度值。
样品空白
在各特定波长下，光通过以生物样品和相应测定项目不含有引起反应的一种或多种成分的试剂构成的反应体系所测得的吸光度值;或由生物样品和相应测定项目试剂构成的反应体系产生反应最初时间所测得的吸光度值。
分析方法分类
终点法
被测物质在反应过程中完全被转变为产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）。实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个动态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当。从时间---吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应终点。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。
终点时间的确定：
①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点。
②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，因此终点时间应采用10～30s，而不应选择10min。
终点测定方法( 1 点法)
临床化学自动分析仪将生物样品与相应的试剂在反应系统(反应杯)内充分混合，在一定温度下，经过一定时间的反应，通过比色系统测得反应平衡后在特定的浓度下，特定时间的吸光度值，读取的吸光度值由微机系统处理并计算测定结果。反应混合物 OD 值 = OD （特定位置）- OD0 （0 位置）图为贝克曼AU5800系列临床化学自动分析仪读取的吸光度值计算示意图。
终点测定方法( 2 点法)在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay）。该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收造成的干扰。在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变化，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法。但指示反应初期吸光度无明显变化的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变化，因而均难以用上述方式设置两点终点法。但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法。在此要注意必须将两次读吸光度时不同比色液体积进行校正。目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不必手工进行校正。
固定时间法
指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），图为贝克曼AU5800系列临床化学自动分析仪固定时间发反应示意图
连续检测法
连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果。
双重速率检测
本检测法通过使用最小平方法计算光度计点之间吸光度差异（OD）的平均值确定每分钟吸光度变异率。然后，系统可根据该计算公式获得目标物质的 OD 率。
透射比浊法
抗原与相应的抗体结合形成的免疫复合物，在反应液中具有一定的浊度，可由一般分光光度法进行透射比浊（transmission turbidimetry）测定，可用于某些蛋白质和药物浓度等的测定。该法须做多点校准，再经非线性回归，求出抗原或抗体的含量。使用散射比浊法（scatter turbidimetry）能更加准确快速地检测抗原抗体形成浊度的大小或其速度。
方法举例
1．终点法检测
常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法
苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法
对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法
透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
